非洲猪瘟暴发前后我国猪繁殖与呼吸综合征病毒的流行变化

赵 静，李 超，许 浒，相丽润，汤艳东，孟凡丹，付 军，龚帮俊，陈家锃，冷超粮，彭金美，王 倩，周国辉，安同庆，童光志，蔡雪辉，张洪亮*，田志军*

（1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨 150069；2.南阳师范学院，河南 南阳 473061；3.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；4.天津渤海农牧产业联合研究院有限公司，天津 300308）

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是引起PRRS的主要病原，为单股正链RNA 病毒，基因组全长约15 000 nt，至少包含11 个开放阅读框（Open reading frame，ORF），编码至少16 种非结构蛋白，分别是Nsp1α、Nsp1β、Nsp2、Nsp2N、Nsp2TF、Nsp3～Nsp6、Nsp7α、Nsp7β、以及Nsp8～Nsp12。8 种结构蛋白分别是GP2a、E、GP3、GP4、GP5、ORF5a、M 和N。PRRSV 属于套式病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒β 属，分为2 个基因型，分别为基因1 型，属于欧洲型动脉炎病毒亚属；基因2 型，属于美洲型动脉炎病毒亚属。根据ORF5 基因，基因1 型PRRSV（Type 1 PRRSV）又分为3 个基因亚型，分别是I、II、III 基因亚型；基因2 型PRRSV 又分为9 个基因亚型，分别是1～9 基因亚型[1-3]。

2006 年中国暴发由高致病性PRRSV（HPPRRSV）引起的高致病性PRRS（HP-PRRS），该类病毒在nsp2 基因中存在30（1+29）个氨基酸的不连续缺失，致病性强，很快成为我国的主要流行株。同年，我国首次分离到了Type 1 PRRSV，然而，该类病毒只是散发，并未流行，2016 年首次报道Type 1 PRRSV 出现重组现象[4]。2012 年，我国报道了与NADC30 同源性较高的PRRSV，称为NADC30-like PRRSV，该类病毒在nsp2 基因中存在131（111+19+1）个氨基酸的不连续缺失，且该类病毒与HP-PRRSV之间基因组序列同源性低、重组频繁，致病性差异较大，自2016 年该病毒已超过HP-PRRSV 成为我国当前主要的流行株[5]。2015 年，我国大陆报道出现QYYZ-like PRRSV，该类病毒在nsp2 基因中存在36个氨基酸的连续插入。根据ORF5 基因分类，大陆出现的QYYZ-like PRRSV 均属于sublineage 3.5，并源于中国台湾的sublineage 3.2 PRRSV[6]。2018 年，我国报道出现NADC34-like PRRSV，该类病毒在nsp2 基因中存在100 个氨基酸的连续缺失，对仔猪的致病性较低，是一种潜在流行株[7]。目前，我国的PRRSV呈现多基因亚型并存的复杂局面。

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由ASF 病毒（ASFV）引起的一种急性、高热和高度接触性传染病，该病是世界卫生组织（OIE）6 种法定报告的动物疫病之一，在我国也属于一类动物疫病[8]。虽然存在自然缺失或基因修饰的ASF 实验疫苗，但目前并无高免疫原性和完全保护效果的商品化疫苗。自2018年8 月辽宁沈阳发生首起ASF 疫情以来，据农业农村部公示，截至2020 年7 月30 日，全国共有28 个省份发生ASF 疫情160 余起（含2 起野猪疫情），累计扑杀生猪120 万余头[9]。中国是生猪产业大国，生猪贸易占据世界贸易量的50%。突然暴发的ASF 疫情使得我国生猪的养殖、屠宰、经营和运输状况均发生了较大改变，对非ASF 的其他猪病的流行也造成了一定影响，为了探究ASF 疫情对PRRSV 流行的影响，本研究检测并统计分析了ASF疫情暴发前后我国大部分地区（华北、华东、中南及东北）4年间（2017年～2020 年）PRRSV 的流行病学变化，为我国PRRSV 的深入研究和PRRS 防控提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 病料样品来源及主要试剂1 374份疑似PRRSV感染的病料样品（肺或血液）采自全国18 个省、市和自治区（黑龙江省、内蒙古自治区、吉林省、辽宁省、河北省、山西省、山东省、河南省、浙江省、江苏省、广东省、安徽省、湖北省、四川省、江西省、新疆自治区、天津市、北京市）各养猪场；大肠杆菌TGI 感受态细胞由本实验室制备[10]。RNA 提取试剂盒购自Tiangen 公司；M-MLV 反转录酶、dNTPs、LATaqDNA 聚 合 酶 和pMD18-T 载 体 等 购 自TaKaRa 公司；Gel Extraction Kit 购自OMEGA 公司。

1.2 引物的设计与合成根据GenBank 中的PRRSV BJEU06-1（GU047344）、HuN4（EF635006）、NADC30（JN654459）、ATCC VR-2332（AY150564）、QYYZ（JQ-308798）和IA/2014/NADC34（MF326985）株全基因组序列，参照文献[11]由库美生物有限公司合成检测PRRSV ORF5 基因与nsp2 基因的两对引物（表1）。

表1 PRRSV的检测引物Table 1 Detective primers of PRRSV

1.3 病料样品ORF5 与nsp2 基因的PCR 扩增及测序将病料样品经组织研磨仪研磨后，8 000 r/min离心，分别取上清液和血清，利用RNA 提取试剂盒提取总RNA，反转录为cDNA 作为模板。分别利用表1 中2 对检测引物经PCR 扩增。并对扩增阳性样品的nsp2 和ORF5 基因回收纯化后与pMD18-T 载体连接，构建重组质粒并经PCR 鉴定，阳性菌液由库美生物有限公司测序。并根据nsp2 和ORF5 基因测序结果统计分析阳性样品的检出率及不同地区在ASF暴发前后PRRSV 阳性检出率的变化趋势。

1.4 ASF 暴发前后我国各亚型及各地区PPRSV 流行变化趋势的统计分析根据阳性病料样品的来源地区和PRRSV 各亚型，利用GraphPad Prism 8.0 统计分析并绘图，分析ASF 暴发前后我国各亚型及各地区PPRSV 的流行变化趋势。

1.5 PRRSV ORF5 基因遗传进化及nsp2 基因推导氨基酸序列缺失特征的分析上述经PCR 扩增的基因分别利用MegAlign 和Seqman 拼接后获得ORF5 及nsp2 基因序列。利用DNAStar 和Mega 7.0 软件对测序所得的ORF5 基因序列与GenBank 中参考株的ORF5基因序列构建系统进化树，分析其遗传变异情况；利用MegAlign 将测序所得的nsp2 基因推导的氨基酸序列与参考株的相应氨基酸序列比对并分析其的缺失特征。

2 结 果

2.1 PRRSV 的PCR 检测及目的基因测序结果对2017 年1 月～2020 年12 月采集的1 374 份疑似PRRSV感染的病料样品进行PCR 检测并统计。结果显示，共检出PRRSV 阳性病料样品779 份，其中ASF 暴发前397 份，ASF 暴发后382 份。对所有阳性样品扩增的ORF5 和nsp2 基因测序并根据测序结果对样品统计分析后的结果显示，ASF 暴发后（2019 年～2020年），我国华北地区PRRSV阳性率由ASF暴发前（2017年～2018 年）的60.47%升至66.33%；东北地区PRRSV阳性率由ASF暴发前的52.76%升至53.27%；华东地区PRRSV 阳性率由ASF 暴发前的60.93%升至62.59%；中南地区PRRSV 阳性率由ASF 暴发前的53.43%升至57.50%（表2）。表明我国华北地区、东北地区、华东地区PRRSV 阳性率在ASF 疫情暴发后均有上升。

表2 我国部分地区在ASF暴发前后的PRRSV检测阳性率Table 2 The positive rate of PRRSV in the different regions of China before or after the outbreak of ASF

2.2 ASF 暴发前后我国各亚型及各地区PPRSV 的流行变化趋势对ASF 暴发前检测的397 株PRRSV和ASF 暴发后检测的382 株PRRSV 的来源地区及其ORF5 及nsp2 基因经GraphPad Prism 8.0 统计并分析。结果显示：ASF 暴发前，HP-PRRSV、NADC30-like PRRSV、NADC34-like PRRSV、VR2332-like PRRSV、QYYZ-like PRRSV、Type 1 PRRSV 的检出率分别为34.01%（135/397）、47.36%（188/397）、1.76%（7/397）、6.80%（27/397）、7.30%（29/397）、2.77%（11/397）；ASF暴发后HP-PRRSV、NADC30-like PRRSV、NADC34-like PRRSV、VR2332-like PRRSV、QYYZ-like PRRSV、CH-1a like PRRSV、Type 1 PRRSV 的检出率分别为20.68%（79/382）、65.97%（252/382）、5.50%（21/382）、3.40%（13/382）、0.52%（2/382）、1.31%（5/382）、2.62%（10/382）（图1）。结果表明，ASF 暴发后，NADC30-like PRRSV 作为主要流行株，其检出率明显升高，HP-PRRSV、VR2332-like PRRSV 和QYYZ-like PRRSV检出率降低。NADC34-like PRRSV 在ASF 暴发后检出率明显上升。 ASF 对PRRSV 各亚型流行情况的影响不同，对国内主要流行的NADC30-like PRRSV、HP-PRRSV 和NADC34-like PRRSV 的影响较大，而对VR2332-like PRRSV、QYYZ-like PRRSV、CH-1a like PRRSV和Type 1 PRRSV的影响较小。

分析我国各地区各亚型PPRSV 的流行变化趋势结果显示：ASF 暴发前，我国华北地区（北京、天津、河北、山西、内蒙古）NADC30-like PRRSV 检出率为55.77%（29/52），HP-PRRSV 检出率为36.54%（19/52），VR2332-like PRRSV、QYYZ-like PRRSV 和Type 1 PRRSV 也有少量检出，未检出NADC34-like PRRSV 和CH-1a like PRRSV；东北地区（辽宁、吉林、黑龙江）NADC30-like PRRSV 检出率为44.76%（47/105），HP-PRRSV 检出率为33.33%（35/105），并检测到NADC34-like PRRSV、VR2332-like PRRSV、QYYZ-like PRRSV 和Type 1 PRRSV，未检出CH-1a like PRRSV；华东地区（江苏、浙江、安徽、江西、山东）NADC30-like PRRSV检出率为52.17%（48/92），HPPRRSV检出率为28.26%（26/92），还检出少量VR2332-like PRRSV、QYYZ-like PRRSV 和Type 1 PRRSV，未检出NADC34-like PRRSV 和CH-1a like PRRSV；中南地区（河南、湖北、湖南、广东、广西）NADC30-like PRRSV 检出率为43.24%（64/148），HP-PRRSV 检出率为37.16%（55/148），还检测到少量NADC34-like PRRSV、VR2332-like PRRSV、QYYZ-like PRRSV 和Type 1 PRRSV，未检出CH-1a like PRRSV（图1）。

图1 ASF暴发前后我国PRRSV各亚型检出率的变化Fig.1 The changes of detection rates and subtypes of PRRSV before and after ASF outbreak in China

ASF 暴发后，我国华北地区NADC30-like PRRSV检出率为56.92%（37/65），HP-PRRSV 检出率为16.92%（11/65），NADC34-like PRRSV 检出率为15.38%（10/65），检出少量CH-1a like PRRSV 和Type 1 PRRSV，未检出VR2332-like PRRSV 和QYYZ-like PRRSV；东北地区NADC30-like PRRSV 检出率为66.48%（119/179），HP-PRRSV 检出率为19.55%（35/179），检出少量NADC34-like PRRSV、VR2332-like PRRSV、CH-1a like PRRSV 和Type 1 PRRSV，未检出QYYZ-like PRRSV；华东地区NADC30-like PRRSV 检出率为65.22%（60/92），HP-PRRSV 检出率为28.26%（26/92），检出少量NADC34-like PRRSV、VR2332-like PRRSV和Type 1 PRRSV，未检出QYYZ-like PRRSV 和CH-1a like PRRSV；中南地区NADC30-like PRRSV 检出率为78.26%（36/46），HP-PRRRSV 检出率为15.22%（7/46），检出少量VR2332-like PRRSV 和QYYZ-like PRRSV，未检出NADC34-like PRRSV、Type 1 PRRSV和CH-1a like PRRSV（图2）。上述结果表明，ASF暴发后，我国大部分地区（华北、东北、华东、中南）的NADC30-like PRRSV流行趋势有所上升。与此同时，我国大部分地区HPPRRSV 的检出率明显下降。并且随着ASF 的流行，除中南地区外，我国各地NADC34-like PRRSV 检出率明显上升。

图2 ASF暴发前后国内各地区各亚型PRRSV检出率的变化Fig.2 The detection rates of different lineages of PRRSV before and after ASF outbreak in different regions of China

2.3 ASF暴发前后PRRSV基于ORF5基因的PRRSV遗传演化分析分别选择ASF暴发前后各51个和43个ORF5 基因序列与各亚型PRRSV 代表株相应基因序列构建系统进化树。结果显示，ASF 暴发前共检测到6种亚型的PRRSV，分别是NADC30-like PRRSV、HPPRRSV、NADC34-like PRRSV、VR2332-like PRRSV、QYYZ-like PRRSV、Type I PRRSV（图3A）；ASF暴发后除以上6 种亚型的PRRSV 外，还检测到了CH-1a like PRRSV（图3B）。表明ASF暴发后我国PRRSV亚型分类变得更加多元化。

图3 2017年～2018年（A）及2019年～2020年（B）分别基于ORF5基因序列的PRRSV的系统进化树Fig.3 Phylogenetic trees based on PRRSV ORF5 gene from during 2017 to 2018(A)and 2019 to 2020(B)

2.4 ASF 暴发前后PRRSV nsp2 基因推导的氨基酸序列位点的分析分别选择ASF 暴发前后各12 个nsp2 基因与参考株nsp2 基因推导的氨基酸序列进行了比对分析。结果显示，与参考株相比，ASF 暴发前后，PRRSV 的缺失特征并未发生变化：NADC30-like PRRSV 仍具有131（111+1+19）个氨基酸缺失特征，HP-PRRSV 仍具有30（1+29）个氨基酸缺失特征，NADC34-like PRRSV 仍具有100 个连续氨基酸缺失特征（图4）。结果表明，ASF 暴发前后各亚型PRRSV 的缺失特征均一致。

图4 ASF暴发前（A）及ASF暴发后（B）nsp2基因推导的氨基酸序列比对结果Fig.4 Alignments results of the deduced amino acid sequence of nsp2 genes before(A)and after(B)the outbreak of ASF

3 讨 论

自2018 年8 月在辽宁沈阳报道第一起ASF 疫情后，为了控制疫情，国家出台了一些紧急应对措施，包括疫情响应标准、疫点的划定与处置、扑杀及无害化处理标准，发现疫情后的紧急流行病学调查，以及养殖场（户）、屠宰场及其他环节监测为ASF 阳性的处理方法等，致国内外生猪的流通情况发生了改变。

PRRSV 的检测以及测序结果表明，ASF 暴发后，国内华东、东北、华北及中南地区PRRSV 的阳性率均有明显上升。在防控ASF 的同时，为避免应激反应，许多猪场停止使用了一些猪病病毒疫苗，其中就包括PRRSV 相关疫苗。正常情况下使用PRRSV 疫苗可以对猪提供有效保护，而在ASF暴发后，PRRSV疫苗的停用导致我国各地PRRSV 检测阳性率的上升，表明疫苗在猪病防控中的重要作用。在ASF 疫情暴发后，我国PRRSV 检测阳性率的上升反映了许多猪场为预防和清除ASF 而忽视或放弃对其他猪病的防控，反而使得猪场内原本已经得到一定控制的传染病再次开始流行，这些情况也表明了建立猪病综合防控体系的重要性。

对ASF 暴发前后（2017 年～2020 年）PRRSV 的遗传演化分析结果显示，我国PRRSV 亚型Nsp 氨基酸的缺失特征均一致，但在ASF 暴发后我国PRRSV 流行情况更加多元化，检测到了更多亚型的PRRSV。国内的NADC30-like PRRSV 在ASF 疫情之前形成了独立分支，但在ASF 暴发后，其并未形成具有优势的独立分支。表明ASF 疫情发生后NADC30-like PRRSV 的遗传演化变得更加复杂。生猪大量的扑杀直接导致了能繁种猪流通数量的减少，为促进产能的回升，全国各地养殖场开始使用三元、四元甚至来源更复杂的杂交品种做种猪，使得疾病的流行情况更加复杂，也造成了ASF 暴发后PRRSV 亚型的增加，对我国PRRS 防控带来了更严峻的挑战。

ASF 暴发后，NADC30-like PRRSV 作为主要流行株，其检出率有显著增长。这种趋势在中南地区表现得更加明显。由于无针对NADC30-like PRRSV 的疫苗，加之频繁发生的重组事件也给NADC30-like PRRSV 的检测和其感染的防控造成了困难[12]。NADC34-like PRRSV 是近年来才被报道的病毒，最初报道于美国，后传播至中国，该类病毒株大多存在重组，但尚未发现其与国内HP-PRRSV 和CH-1a like PRRSV 的重组[13-14]，之前有报道称其可能是潜在的流行株[7]。根据本研究的分析统计结果，在此次ASF 疫情暴发后，NADC34-like PRRSV 的检出率上升。因此，从业人员应加大对该亚型PRRSV流行情况的监控，对其的鉴别诊断试剂盒和疫苗做储备性研究，并开发应对的防控措施。随着ASF疫情对生猪流通的影响，表明ASF 暴发前后VR2332-like PRRSV、QYYZ-like PRRSV、CH-1a like PRRSV 和Type 1 PRRSV在不同地区检出率的变化表明这些亚型PRRSV 的流行仍具有地域性，应加强区域内动物疫病监测、动物卫生监督、优化流通控制模式。

本研究通过检测并统计分析了ASF 暴发前后国内PRRSV 的流行变化，表明ASF 暴发后国内大部分地区PRRSV 的流行更加严重，流行亚型更加多元；国内NADC30-like PRRSV 的检出率大幅度上升，HP-PRRSV 的检出率大幅降低，NADC34-like PRRSV流行有上升趋势。本研究分析了ASF 疫情对我国PRRSV 流行变化的影响及目前国内PRRSV 的流行现状，为我国PRRS 的防控提供了数据支持。