Vonafexor(EYP001)的合成

2022-07-05刘洪涛田文华李文燕

河北师范大学学报（自然科学版） 2022年4期

姜珊，刘洪涛, 田文华，李文燕

(1.河北师范大学化学与材料科学学院，河北省有机功能分子重点实验室,河北石家庄 050024;2.河北省人民医院药学部，河北石家庄 050051)

Vonafexor(EYP001)是非胆酸类法尼醇X受体选择性激动剂，法尼醇X受体(famesod X receptor，FXR)是核受体超家族中的一员[1].FXR可以调控胆汁酸、脂质和糖类的代谢，影响胆淤积、糖尿病、高血脂、动脉粥样硬化和肥胖症等病理过程[2]，对肾上腺、肠、肾和肝脏也有重要影响[3].有研究发现，FXR与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的复制有关.HBV感染是全球性的健康问题，中国的境况更为严峻，现有临床药物难以彻底治愈慢性乙肝.共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)是HBV感染初期能最先检测到的复制中间体，也是嗜肝DNA病毒、病毒基因和前基因组RNA的合成模板[4].在HBV的复制过程中[5]，cccDNA起到了非常关键的作用，它是病毒复制的中介，在宿主肝细胞核内以微染色体的形式存在，半衰期可持续数十年，目前的治疗手段均难以将其彻底清除，导致慢性乙肝无法彻底治愈[6-7].因此，只有直接作用于共价闭合环状DNA、抑制它的形成，转录或直接封闭和降解cccDNA才能彻底清除HBV[8].目前，在进入临床的新型抗HBV的药物中，只有FXR激动剂可以有效地抑制或清除共价闭合环状DNA[9-10].非酒精性脂肪性肝炎[11-13](national association of specimeen hunters，NASH)是一种严重的非酒精性脂肪性肝病，发病率高，可发展为肝纤维化、肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌.中国非酒精性脂肪性肝病患病率为20.1 %，已成为慢性肝病以及肝移植的主要病因.FXR激动剂可以减缓非酒精性脂肪性肝病的肝细胞脂肪变性和脂质沉积，对肝脏起到保护作用[14].Vonafexor(EYP001)是法国Eyno公司研发的一种非胆酸类选择性FXR激动剂，目前正用于慢性乙型肝炎和NASH的II期临床研究中[15].为进一步研究该化合物，本文中，笔者以5-溴水杨醛为起始原料，通过2步反应生成5-溴苯并呋喃-2-甲酸乙酯中间体1，然后1与1-Boc哌嗪反应生成中间体2，2通过氯原子取代反应得到中间体3，将3进行脱Boc反应后得到中间体4，再与2,6-二氯苯磺酰氯反应，得到中间体5，最后通过水解反应得到最终产物EYP001.目标产物总收率为58.3 %(按5-溴水杨醛计).合成路线见图1.其中，a为溴乙酸乙酯,K2CO3,NMP,65 ℃;b为DBU,EtOH,回流;c为Pd(OAc)2,BINAP,Cs2CO3,甲苯,100 ℃;d为浓H2SO4,THF,40 ℃;e为TAF,CH2Cl2;f为吡啶,THF,室温;g为THF,10 %NaOH,EtOH.

图1 目标化合物的合成路线Fig.1 Synthetic Route of Target Compound

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

薄层监测用2F-20D暗箱式紫外分析仪(巩义市予华仪器有限责任公司)；质谱用3200 QTRAP 1200 infinity series质谱仪(美国 AB Sciesx 公司)；高分辨质谱用AB Sciesx TripleTOF 5600+(美国 AB Sciesx 公司)；核磁共振用WIPM-NMR-400核磁共振波谱仪(中科牛津波谱技术有限公司)，四甲基硅烷(TMS)为内标.

化学试剂均为市售、分析纯.

1.2 实验步骤

1.2.1 5-溴苯并呋喃-2-甲酸乙酯(1)的制备

取干燥的50 mL茄形瓶，加入5-溴-2-羟基苯甲醛2.00 g(10.00 mmol)，加入20 mL的N-甲基吡咯烷酮溶解，再向反应瓶中加入K2CO32.76 g(20.00 mmol)，室温下搅拌 20 min后向反应瓶中滴加溴乙酸乙酯1.60 mL(14.00 mmol)，升温至65 ℃，TLC监测反应进程,30 min后反应完全.向反应液中加入20 mL水，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相,用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥.滤除干燥剂，滤液减压浓缩，得到黄色油状中间体的粗产品2.50 g;用20 mL无水乙醇溶解，在室温搅拌下缓慢向反应瓶中滴加1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU) 2.0 mL(13.38 mmol)，滴加完毕后，100 ℃加热回流，TLC监测反应进程,约1 h 后反应完全.将反应液冷却至室温，除去大部分溶剂，冰水浴下向25 mL冰水中滴加浓缩的反应液，搅拌，有固体析出，减压抽滤，用蒸馏水洗涤滤饼.真空干燥后得到中间体1(淡黄色固体)2.41 g，收率为 90 %.1HNMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.80(d，J=1.3 Hz，1H)，7.55～7.49(m，1H)，7.46(s，1H)，7.44(s，1H)，4.44(q，J=7.1 Hz，2H)，1.42(t，J=7.1 Hz，3H).13CNMR(101 MHz，CDCl3)δ:159.18，154.34，146.83，130.59，128.86，125.33，116.89，113.90，112.85，61.80，14.34.ESI-MS，m/z：269.0[M+H]+，291.2[M+Na]+.

1.2.2 5-(4-叔丁氧羰基哌嗪)苯并呋喃-2-甲酸乙酯(2)的制备

将30 mL甲苯置于三颈瓶中，在室温条件下，用流动的氮气做保护，加入40 mg醋酸钯，搅拌溶解后加入0.11 g BINAP，6.26 g(19.27 mmol)碳酸铯，搅拌20 min，再加入2.40 g(9.64 mmol)中间体1和3.13 g(10.60 mmol)1-Boc哌嗪，搅拌10 min 后升温至100 ℃.TLC监测反应进程，7 h后反应结束.将反应液冷却至室温，向反应液中加入50 mL水，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，依次用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥;次日减压抽滤，滤液减压浓缩后进行柱层析分离(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=10∶1)，得到中间体2(淡黄色固体)2.85 g，收率为85 %.1HNMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.45(d，J=9.1Hz，1H)，7.41(s，1H)，7.13(d，J=9.1Hz，1H)，7.07(s，1H)，4.40(q，J=7.1 Hz，2H)，3.62～3.54(m，4H)，3.07(s，4H)，1.46(s，9H)，1.39(t，J= 7.1 Hz，3H).13CNMR(101 MHz，CDCl3)δ:159.51，154.68，151.27，148.73，146.24，127.57，120.41，113.73，112.67，109.04，79.86，61.36，51.07，28.44，14.31.ESI-MS，m/z：375.1[M+H]+，397.2[M+Na]+.

1.2.3 4-氯-5-(4-叔丁氧羰基哌嗪)苯并呋喃-2-甲酸乙酯(3)的制备

将2.80 g(10.78 mmol)中间体2加入到30 mL四氢呋喃中，搅拌溶解后加入2.80 mL浓硫酸，将1.54 g(11.48 mmol)N-氯代丁二酰亚胺(NCS)溶于四氢呋喃中，25 ℃下缓慢滴入反应液中，滴加完毕后，40 ℃加热反应，TLC监测反应进程，1 h后反应完全.冷却至室温后，蒸除溶剂，加水，用乙酸乙酯萃取3次，依次用水、饱和食盐水洗涤.有机相用无水硫酸镁干燥，2 h后抽滤，滤液减压浓缩后得到中间体3(白色固体)3.03 g，收率为89 %.1HNMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.59(s，1H)，7.46(d，J=8.8 Hz，1H)，7.21(d，J=8.6 Hz，1H)，4.44(q，J=7.1 Hz，2H)，3.67～3.60(m，4H)，3.01(s，4H)，1.49(s，9H)，1.43(t,J=7.2 Hz，3H).13CNMR(101 MHz，CDCl3)δ：159.06，154.80，152.01，146.60，145.21，128.07，121.62，120.59，112.42，110.97，79.77，61.63，51.78，28.43，14.26.

ESI-MS，m/z：408.7[M+H]+，430.9[M+Na]+.

1.2.4 4-氯-5-(哌嗪基)苯并呋喃-2-甲酸乙酯(4)的制备

将3.00 g中间体3溶于15 mL二氯甲烷中，向反应瓶中滴加三氟乙酸(15 mL)，室温搅拌，TLC监测反应进程,20 min后反应完全.冰水浴搅拌下，用饱和碳酸钠水溶液将反应液pH调成中性.随后用二氯甲烷萃取反应液，有机相用无水硫酸镁干燥后，减压抽滤，滤液减压浓缩得到粗产品中间体4(白色固体)2.10 g，收率为93 %.此步反应未经纯化直接投入下步反应.

1.2.5 4-氯-5-[4-(2,6-二氯苯磺酰基)-1-哌嗪基]苯并呋喃-2-甲酸乙酯(5)的制备

将2.00 g中间体4粗产品加入50 mL茄形瓶中，用重蒸的四氢呋喃(25 mL)溶解，将5.76 mL(71.28 mmol)吡啶分3次加入反应瓶，每间隔1 h加入1次，每次加完吡啶后，加入1.75 g(7.12 mmol)2，6-二氯苯磺酰氯，也分3次加入.室温搅拌反应，TLC监测反应进程,7 h后反应完全.将反应液减压蒸馏除去溶剂，向反应液中加入20 mL水，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相依次用水、饱和食盐水洗涤.有机相用无水硫酸镁干燥后抽滤，滤液减压浓缩后进行重结晶(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=4∶1)，得到中间体5(白色固体)3.09 g，收率为92 %.熔点212～214 ℃.1HNMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.57(s，1H)，7.48(dd，J=13.2，8.2 Hz，3H)，7.38～7.31(m，1H)，7.21(d，J=8.9 Hz，1H)，4.44(q，J=7.1 Hz，2H)，3.68～3.60(m，4H)，3.17～3.10(m，4H)，1.42(t，J=7.1 Hz，3H).13CNMR(101 MHz，CDCl3)δ：159.10，152.17，146.68，144.45，135.74，134.72，131.92，131.63，128.07，121.68，111.35，111.06，61.82，51.78，51.70，51.63，14.38，14.25.ESI-MS，m/z：518.8[M+H]+，540.8[M+Na]+.

1.2.6 Vonafexor(EYP001)的合成

向50 mL 茄形瓶中加入3.00 g中间体5，四氢呋喃(50 mL)为溶剂，加入50 mL 10 % NaOH(质量分数)水溶液，室温搅拌反应，TLC监测反应进程，2 h后反应完全.减压除去反应液中大部分溶剂，冰水浴下，1 mol/L HCl溶液将反应液调至酸性，有大量的白色固体析出，减压抽滤，蒸馏水洗涤滤饼，滤饼经重结晶(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=4∶1)纯化，真空干燥后得到纯品2.52 g，收率为89 %，熔点288～290 ℃.1HNMR(400 MHz，DMSO)δ:7.81～7.74(m，2H)，7.68(dd，J=8.8，7.2 Hz，1H)，7.61(d，J=8.8 Hz，1H)，7.30(d，J=8.9 Hz，1H)，7.18(s，1H)，3.53(s，4H)，3.15～3.04(m，4H).13CNMR(101 MHz，DMSO)δ:161.45，155.04，144.22，135.06，134.62，133.95，132.72，128.71，119.98，119.47，111.37，107.08，51.75，46.30.高分辨质谱HR-MS：C19H15Cl3N2O5SH for[M+H]+，理论计算值为488.976 7，测试数值为488.955 8.

2 反应条件的优化

碳氮偶联反应见式(1).在实验过程中，碳氮偶联反应比较难发生，反应条件苛刻.为了促进反应发生，加入催化剂膦配体.膦配体、碱、溶剂等反应条件的优化结果见表1.

(1)

表1 苯并呋喃环碳氮偶联反应条件Tab.1 C-N Coupling Reaction Conditions of Benzofuran Ring

苯并呋喃环碳氮偶联反应条件比较苛刻，该反应以醋酸钯作催化剂，加入有机膦配体，在碱性条件和氮气保护下进行反应.为了提高反应收率，对膦配体、碱、温度和溶剂等条件进行了优化.尝试了Ph3P/NaH,Ph3P/t-BuONa等组合，发现反应不能发生.换用(t-Bu)3P/t-BuONa并用甲苯作溶剂,升高反应温度后能够发生反应，但产物杂乱，没有目标产物生成.随后降低反应体系碱性，用(t-Bu)3P/Cs2CO3催化，能够得到目标产物但是转化率较低.将配体换为BINAP后，产率有所提高，分别用t-BuONa,K2CO3,Cs2CO3催化，发现Cs2CO3对反应最为有利，产率可达85 %.因此，此步反应条件最终确定为氮气保护，Pd(OAc)2/BINAP/Cs2CO3催化，100 ℃，在甲苯中反应.