HPLC法测定阿戈美拉汀片中的有关物质

付晓伟，李 丽

（1.天津市蓟州区人民医院，天津 301900；2.天津医科大学，天津 300203）

阿戈美拉汀片用于治疗成人抑郁症，2009年2月在欧盟首次获得批准，现已在所有欧盟国家及冰岛上市。在国内，原研厂家法国施维雅于2011年11月获准进口，2014年12月国内厂家江苏豪森药业股份有限公司获得仿制药批准上市。阿戈美拉汀具有全新的作用机制，是一种褪黑素激动剂，其同人体褪黑素MT1和MT2受体具有很高的亲和力。阿戈美拉汀能特异性地增加前额皮质去甲肾上腺素和多巴胺的释放，细胞外五羟色胺水平未见明显影响。受体结合试验结果显示，阿戈美拉汀对单胺再摄无明显影响，对α肾上腺素受体、β肾上腺素受体、组胺受体、胆碱能受体、多巴胺受体以及苯二氮类受体无明显亲和力［1-4］。笔者采用HPLC对阿戈美拉汀片中的4种有关物质同时进行测定，可有效地检测其杂质（见表1），方法灵敏、准确。

表1 阿戈美拉汀片有关物质基本信息

1 材料

1.1 仪器 Waters E2695高效液相色谱仪（PDA检测器），Empower色谱工作站（美国沃特斯公司）；METTLER XSE105十万分之一电子天平（瑞士梅特勒公司）；Zorbax Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色谱柱（美国安捷伦公司）。

1.2 药品与试剂 阿戈美拉汀片（法国施维雅药厂，批号H20160108、H20160109、H20160110，规格：25 mg/片）；阿戈美拉汀对照品（批号15001，含量为100.1%）；杂质Ⅰ对照品（批号16012，纯度为99.5%）、杂质Ⅱ对照品（批号16032，纯度为99.1%）、杂质Ⅲ对照品（批号16028，纯度为99.4%）、杂质Ⅳ对照品（批号16024，纯度为99.6%）均购自四川省维克奇生物科技有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯（天津康科德科技有限公司）；其余试剂均为市售分析纯；水为屈臣氏水（纯化水）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Waters E2695高效液相色谱仪，Zorbax Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色谱柱；流动相为0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液（磷酸调节pH值至5.0）-乙腈-甲醇（70∶12∶18），流速为1.2 ml/min；检测波长为230 nm，柱温：35℃，进样量：10μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 杂质对照品溶液 取杂质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ约10 mg，分别置于10 ml量瓶中，加流动相适量，超声使溶解，放至室温，加溶媒至刻度，摇匀，分别作为杂质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ储备液。取上述杂质Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ储备液，分别用流动相稀释至1μg/ml；取杂质Ⅱ储备液，用流动相稀释至3μg/ml。

2.2.2 供试品溶液 取阿戈美拉汀片研细粉适量（含阿戈美拉汀1.0 mg），置10 ml量瓶中，加流动相适量，超声10 min使溶解，放至室温，流动相稀释至刻度，离心，取上清液，制成每1 ml中约含阿戈美拉汀100μg的供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液 称取处方比例混合辅料适量，置10 ml量瓶中，加流动相适量，超声10 min，用流动相稀释至刻度，离心，取上清液。

2.2.4 系统适用性溶液 分别取阿戈美拉汀及杂质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各适量，置同一10 ml量瓶中，用流动相稀释制成每1 ml中约含阿戈美拉汀100μg，杂质Ⅱ3μg，杂质Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ1μg的混合对照溶液，作为系统适用性溶液。

2.3 系统适用性与专属性试验 精密量取“2.2”项下供试品溶液、阴性对照溶液和系统适用性溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。理论板数按阿戈美拉汀计算不低于5 000，阿戈美拉汀峰与杂质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ峰之间的分离度应符合要求，空白和辅料不干扰测定。见图1。

图1 系统适用性溶液（A）供试品（B）阴性对照（C）HPLC色谱图

2.4 降解试验

2.4.1 酸降解 精密称取片剂细粉12.8 mg（约相当于阿戈美拉汀1 mg，批号H20160108），置于量瓶中，加1.0 mol/L盐酸溶液3 ml，放置4 h，加1.0 mol/L氢氧化钠溶液调节pH为中性，加流动相，超声10 min后，取出，加流动相至刻度，摇匀，取该溶液离心，取上清液，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

2.4.2 碱降解 精密称取片剂细粉12.8 mg（约相当于阿戈美拉汀1 mg，批号H20160108），置于量瓶中，加1.0 mol/L氢氧化钠溶液3 ml，放置4 h，加1.0 mol/L盐酸溶液调节pH为中性，加流动相，超声10 min后，取出，加流动相至刻度，摇匀，取该溶液离心，取上清液，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

2.4.3 氧化降解 精密称取片剂细粉12.8 mg（约相当于阿戈美拉汀1 mg，批号H20160108），置于量瓶中，加30%过氧化氢溶液2 ml，摇匀，加流动相，超声10 min后，取出，加流动相稀释至刻度，摇匀，取该溶液离心，取上清液，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

2.4.4 高温降解 精密称取样品细粉12.8 mg（约相当于阿戈美拉汀1 mg，批号H20160108），置于量瓶中，加流动相，超声10 min后，于90℃水浴中加热4 h，取出，放冷至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀，取该溶液离心，取上清液，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

2.4.5 光照降解 精密称取样品细粉12.8 mg（约相当于阿戈美拉汀1 mg，批号H20160108），置于量瓶中，加流动相，超声10 min后，于日光下照射1周，取出，加流动相稀释至刻度，摇匀，取该溶液离心，取上清液，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

结果表明，阿戈美拉汀片经酸降解、碱降解、氧化降解、高温降解和光照降解后，各杂质峰之间及与主成分峰均能完全分离。同时有关物质均没有显著变化。见图2。

图2 酸降解（A）碱降解（B）氧化降解（C）高温降解（D）光照降解（E）高效液相色谱图

2.5 线性关系考查 精密量取“2.2.1”项下1%杂质对照品溶液适量，用流动相逐步稀释使成梯度浓度，分别精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度为横坐标（X），以相对应的峰面积为纵坐标（Y），分别进行线性回归，并以斜率计算校正因子，各杂质的回归方程和校正因子见表2。

表2 各杂质的回归方程和校正因子

2.6 定量限与检测限考查 《中国药典》中定义，检测限系指试样中被测物能被检测出的最低量。定量限系指试样中被测物能被定量测定的最低量。常用的方法有直观法、信噪比法与基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法，本试验采用信噪比法确定定量限与检测限。精密量取“2.2.1”项下1%杂质对照品溶液适量，采取逐步稀释法测定，记录色谱图。以信噪比（S/N）为10∶1计算定量限，以信噪比（S/N）为3∶1计算检测限。杂质Ⅰ、杂质Ⅱ、杂质Ⅲ和杂质Ⅳ的检测限分别为0.8、3.0、1.0和0.6 ng，相当于样品浓度的0.08%、0.3%、0.1%和0.06%。定量限分别为1.5、6.4、2.3和1.3 ng，相当于样品浓度的0.15%、0.64%、0.23%和0.13%。

2.7 精密度试验 取“2.2.4”项下的系统适应性溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积。杂质Ⅰ、杂质Ⅱ、杂质Ⅲ、杂质Ⅳ和阿戈美拉汀峰面积的RSD分别为1.1%、1.7%、0.8%、1.3%和0.5%，表明色谱系统精密度良好。

2.8 稳定性试验 取“2.2.2”项下的供试品溶液，分别于室温条件下放置0、4、6、8、12和24 h后取样测定，记录色谱图。结果表明，杂质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均未检出，总杂也没有变化。说明供试品溶液24 h内稳定。

2.9 重复性试验 按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液共6份，按“2.1”项下色谱条件进样测定，杂质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均未检出，表明本方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验 精密称取片剂细粉12.8 mg（约相当于阿戈美拉汀1 mg）（批号H20160108），共6份，分别置于10 ml量瓶中，加入杂质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果杂质Ⅰ的平均回收率为100.1%，RSD为0.7%；杂质Ⅱ平均回收率为99.8%，RSD为0.5%；杂质Ⅲ平均回收率为99.7%，RSD为2.0%；杂质Ⅳ平均回收率为99.8%，RSD为1.3%，具体见表3-6。

表3 杂质Ⅰ加样回收率试验结果（n=6）

表4 杂质Ⅱ加样回收率试验结果（n=6）

表5 杂质Ⅲ加样回收率试验结果（n=6）

表6 杂质Ⅳ加样回收率试验结果（n=6）

2.11 有关物质测定 取3批片剂细粉各适量（约相当于阿戈美拉汀1 mg），分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果3批样品杂质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均未检出，其他最大单一杂质均小于0.2%，总杂均小于2%。结果见表7。

表7 有关物质测定结果

3 讨论

首先，基于化合物的性质和杂质谱的情况进行了流动相的筛选，分别试用了纯水体系、乙酸盐体系、磷酸盐体系，磷酸盐体系中各个杂质的峰型是最好的，其他体系中主峰的色谱柱峰型矮胖，同时拖尾严重。进一步优化磷酸盐体系，分别选择磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，优选磷酸氢二钠，同时对于pH和有机相的种类进行了优化，磷酸体系中使用磷酸氢二钠的量最少，有利于色谱柱的长期使用，最终确定流动相为0.01 mol/L磷酸氢二钠溶液（pH=5.0）-乙腈-甲醇。其次，色谱柱对于分离是十分重要的，不同的色谱柱分离效果差异显著，作者基于实验室内常规的C18色谱柱进行筛选，对Zorbax Eclipse Plus C18、Zorbax Eclipse Plus XDB C18、Zorbax SB C18、Zorbax Extend C18和Zorbax TC C18进行了比较，其中Zorbax Eclipse Plus C18对于杂质Ⅱ与阿戈美拉汀的分离度是最好的，同时保证出峰时间合适，峰型的对称性好，主峰的峰纯度符合要求，优选Zorbax Eclipse Plus C18为最终的色谱柱。最后，在流动相体系与色谱柱确定的基础上，对于其他色谱条件进行了优化，比如流速、柱温等进行了系统的优化，色谱柱的温度对于分离是有影响的，温度越低，分离度越好，当温度低于30℃时分离度变差，本文分别考查了45、40、35、30和25℃，优选35℃；流速对于分离度的影响比较小，没有过多的进行优化。

经方法学验证，建立的高效液相色谱法可用于本品有关物质检查。自研片与国外片有关物质进行比较，杂质谱基本一致。自研片在无外包装、影响因素试验条件下放置5、10和30 d，有关物质无显著变化；在铝塑包装外套复合膜袋包装，加速试验、长期稳定性试验条件下放置6个月，有关物质无显著变化。根据多批次的样品测定结果（见表7），最大单杂均小于0.1%，总杂均小于0.1%。因此，暂定单一杂质应小于0.2%；总杂质应小于1.0%。

综上所述，采用作者建立的HPLC法进行阿戈美拉汀片的有关物质的控制，该方法快速、准确，同时经过了全面的方法学验证，均符合相关要求。