胆汁混合蒸制前后钩吻成分差异及急性毒性研究

陈倪济世，檀兴慧，卢淑珍，王文义，李德森，吴水生

（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

钩吻［Gelsemium elegans（Gardn.et Champ.）Benth.（GE）］，为马钱科胡蔓藤属植物，性温，味辛、苦，有大毒，全草可入药，具有祛风散瘀、消肿止痛、攻毒杀虫的功效。《神农本草经》谓之：“主金创乳痓，中恶风，咳逆上气，水肿，杀鬼疰蛊毒。”《吴普本草》称其：“有毒，杀人。”生物碱既是活性成分，也是毒性成分，主要包括钩吻素子、钩吻素甲、胡蔓藤碱乙、胡蔓藤碱丙、钩吻素己等［1］。现代药理、毒理学研究表明钩吻具有良好的抗感染、抗肿瘤、镇静镇痛、散瞳、影响免疫功能等多种药理功能，更是具有“止痛不成瘾”的特点［2-5］。因钩吻复杂的毒、效关系，近年来学者提出诸多减毒存效方案，主要包括砂炒减毒［6］、配伍玉叶金花减毒［7］、双向固体发酵减毒［8］、“方证相关”减毒［9］。钩吻减毒物质基础可能与钩吻生物碱中的钩吻素己的含量显著被降低有关［10］。但目前钩吻减毒方案尚未能确保钩吻临床应用安全性和有效性。

胆汁炮制自古有之，发展至今可分为胆汁炙炒、胆汁扮晒、胆汁拌润发酵、胆汁混合蒸制法、胆汁混合发酵后蒸制法等，采用胆汁炮制的代表性药物有天南星、黄连、化风丹药等［11-13］。现代胆汁炮制机制研究发现胆汁炮制可转变药性、降低毒性，通过其中胆汁酸与中药成分尤其是生物碱类成分发生相互作用，可发挥减毒增效作用［14］。钩吻主要物质为生物碱类成分，其性温，胆汁性凉，温凉互制，课题组前期研究表明动物胆汁对钩吻生物碱成分及毒性具有重要影响。

中药指纹图谱可从化学成分角度对不同批次药材进行相似度评价，结合化学模式识别，可以较为全面地反映中药质量，被广泛用于评价不同产地/批次/炮制等多种样品质量及筛选差异标志物［15-17］，为中医药多成分的复杂模式研究提供基础。故本研究通过胆汁对钩吻进行混合蒸制得到钩吻胆汁混合蒸制品（下称胆钩吻），建立HPLC 指纹图谱结合多元化统计分析评价钩吻生品与胆钩吻HPLC 指纹图谱差异，筛选二者成分差异，并进一步通过小鼠急性毒性实验观察钩吻生品与胆钩吻的急性毒性死亡率差异，旨在提出钩吻新的炮制减毒方案，阐明胆汁炮制钩吻减毒内在机制，为钩吻临床安全、合理应用提供实验基础。

1 实验材料

1.1 仪器 2695 型高效液相色谱仪、2996 型检测器均购自美国Waters 公司；GT-2120QTS 型智能超声波清洗机（广东固特超声股份有限公司）；EC21-21T01 型多功能电磁炉（广东美的生活电器制造有限公司）；TDL-40B 离心机（上海安亭科学仪器厂）；AR223CN 型千分之一电子天平［奥豪斯仪器（上海）有限公司］；R-1001VN 旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；ME204E 型万分之一电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］。

1.2 药材 钩吻药材分别采自福建永泰、福建晋安、福建泉州、福建厦门、福建漳州、广西河池、广东肇庆、云南文山，编号为S1～S7、S10，S1 老茎、嫩茎编号为S8、S9，经福建中医药大学药学院黄泽豪教授鉴定为马钱科胡蔓藤属植物钩吻［Gelsemium ele⁃gans（Gardn.et Champ.）Benth.］的根、茎；猪胆粉（批号：2021030）购自福建省泉州市永春县东平镇。

1.3 试剂 钩吻素甲对照品（批号：MUST-15071312，纯度≥98%）、钩吻素子对照品（批号：MUST-15062614，纯度≥99%）、钩吻素己对照品（批号：MUST-14100901，纯度≥96%）均购自成都曼思特生物科技有限公司；胡蔓藤碱丙对照品（批号：BBP02553，纯度≥97.5%）、胡蔓藤碱乙对照品（批号：BBP02653，纯度≥95%）均购自云南西力生物技术股份有限公司；钩吻绿碱对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：P15A10S85857，纯度≥95%）；常绿钩吻碱对照品（武汉天植生物技术有限公司，批号：CFS201902，纯度≥98%）；水为超纯水，甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.4 动物 清洁级6～8 周龄ICR 小鼠，体质量18～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005，饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF 级动物实验室，许可证号：SCXK（闽）2019-0007，（24±2）℃屏障环境中适应性喂养7 d，自由饮食。

2 方法与结果

2.1 胆钩吻的制备 取S1～S10 共10 批钩吻药材，粉碎，过60 目筛，取粉末适量，参照吴真等报道［18］，采用混合蒸制法炮制工艺：加入4 倍量猪胆粉，加水充分润湿，拌匀，置于蒸锅中隔水蒸制60 min，于烘箱60 ℃干燥，即得胆钩吻，编号分别为PS1～PS10。钩吻生品为棕黄色粉末，猪胆粉为灰黄色粉末，二者混合物为淡棕色。蒸制过程中，胆钩吻颜色逐渐由淡棕色变为褐色、浅褐色，烘干后颜色为棕褐色；炮制前猪胆粉有明显腥味，蒸制后腥臭味变淡。钩吻生品与胆钩吻炮制前后性状比较（以S10、PS10 为例），见图1。

图1 钩吻生品与胆钩吻性状比较

2.2 钩吻生品与胆钩吻HPLC 指纹图谱的建立

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX Bonus-RP Analytical 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱，0～25 min，2%～10%A；25～40 min，10%～20%A；40～45 min，20%～32%A；45～55 min，32%～40%A；55～68 min，40%～20%A；68～70 min，20%～2%A；70～75 min，2%～2%A；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2.2 标准品溶液的制备 精密称定钩吻素子、钩吻素己、钩吻素甲、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙、胡蔓藤碱丙、常绿钩吻碱对照品适量，分别置于10 mL 容量瓶，加甲醇定容，超声辅助溶解，配置成质量浓度分别为156.00、142.00、149.00、68.00、100.00、110.00、146.00 μg/mL，于4 ℃条件下保存，备用。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密称定钩吻生品（过60 目筛）0.200 g、胆钩吻各样品粉末适量（相当于钩吻生品0.200 g），置于具塞锥形瓶中，精密加入配制的含0.1%甲酸的50%甲醇溶液25 mL，密塞，称重，超声提取30 min，放冷；再次称重，用含0.1%甲酸的50%甲醇溶液补足失量，充分摇匀，3 500 r/min离心10 min，0.22 μm 微孔 滤 膜 滤过，取续滤 液即得。

2.2.4 方法学考察 按“2.2.3”项下方法分别制备钩吻生品与胆钩吻10 批药材供试品，进行液相检测，建立钩吻生品及胆钩吻药材HPLC 分析方法，并以S10、PS10 供试品溶液进行方法学考察，以常绿钩吻碱色谱峰为参照峰，计算主要共有峰的相对保留时间与相对峰面积。精密度、稳定性、重复性结果均表明钩吻生品、胆钩吻各成分峰相对保留时间和相对峰面积RSD 值均＜5.00%，表明建立的方法适用于钩吻生品及胆钩吻成分分析，钩吻7 种生物碱成分混合标准品HPLC 分析图见图2。

图2 钩吻7 种生物碱成分混合标准品HPLC 分析图

2.3 钩吻生品与胆钩吻共有峰的标定 按“2.2.3”项下方法分别制备10 个批次钩吻生品与胆钩吻供试品，进行HPLC 分析，得到10 个批次钩吻生品与胆钩吻样品HPLC 色谱图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2012 版）”进行色谱峰匹配，样品S10 和PS10 图谱分别作为参照图谱，选择中位数法生成对照指纹图谱，采用多点校正法建立指纹图谱，得到钩吻生品与胆钩吻10 个批次药材HPLC 指纹图谱，其中R 为对照指纹图谱，见图3A、图3B。钩吻生品共标定15 个共有峰，胆钩吻共标定17 个共有峰；胆钩吻色谱峰6、7、8、9、10、11、16、17 面积降低（P均＜0.05），色峰峰2、13 面积均升高（P均＜0.05），色谱峰4、15 差异无统计学意义。S 样品中色谱峰峰18、19、20 未被标记为胆钩吻共有峰，可能是因为成分含量较低无法识别。PS 样品中色谱峰1、3、5、12、14 未能与S 样品共有，可能是炮制后形成的新成分。通过对照品指认，6、7、8、9、10、11、16 号色谱峰依次为胡蔓藤碱丙、钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙、常绿钩吻碱。根据指纹图谱计算每批样品指纹图谱相似度，S1～S10 与其对照指纹图谱相似度分别为0.931 、0.863 、0.858、0.979、0.787、0.854、0.826、0.975、0.744、0.894，PS1～PS10 与其对照指纹图谱相似度分 别 为0.999、0.999、0.999、0.998、0.999、0.999、0.999、1.000、1.000、0.999，表明不同批次钩吻质量存在一定差异，胆钩吻质量一致性较好。

图3 10 批钩吻生品与胆钩吻HPLC 指纹图谱

2.4 钩吻生品与胆钩吻指纹图谱多元化统计分析

2.4.1 层次聚类分析（hierarchical clustering analysis，HCA） 将S1～S10 批次钩吻生品与PS1～PS10批次胆钩吻共有峰的峰面积数据输入悟空平台（https：//www.omicsolution.org/wkomics/main），进 行HCA 分析，数据进行标准化处理，结果见图4。由图4可见钩吻生品与胆钩吻可明显聚为2类，其组成差异通过热图直观体现，钩吻生品中色谱峰6、7、8、9、10、11、16、17 峰面积明显高于胆钩吻，而色谱峰2、4、13、15峰面积在胆钩吻中峰面积相对较高。

图4 钩吻生品与胆钩吻样品聚类图

2.4.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 将10 个批次钩吻生品与胆钩吻中共有峰的峰面积数据进行PCA 分析，从12 个共有峰中提取出2 个贡献率最大的主成分，对原始数据差异的贡献率为68.9%，以此2 个主成分对样品进行分析，钩吻生品与胆钩吻明显分为2 类，PCA 得分见图5。

图5 钩吻生品与胆钩吻PCA 得分图

2.4.3 基于正交信号校正的偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA） 对钩吻生品与胆钩吻指纹图谱数据进行OPLS-DA分析。建立OPLS-DA模型，该模型解释和预测能力较好（模型参数：R2X＝0.924，R2Y＝0.991，Q2＝0.928），见图6A、图6B。通过图6A OPLS-DA得分图发现：钩吻生品与胆钩吻明显分布在2 个象限，表明其化学成分具有显著差异。进一步以差异变量（variable influence on projection，VIP）＞1 作为筛选标准，筛选出钩吻生品与胆钩吻主要差异色谱峰，见图6B。图6B 显示：色谱峰2、8（钩吻素子）、9（钩吻素己）、11（胡蔓藤碱乙）为其主要指标性差异成分，其中色谱峰8（钩吻素子）、峰9（钩吻素己）、色谱峰11（胡蔓藤碱乙）峰面积高于胆钩吻，色谱峰2 峰面积低于胆钩吻。

图6 钩吻生品与胆钩吻OPLS-DA 及VIP 得分图

2.5 钩吻生品与胆钩吻毒性比较

2.5.1 药物制备 取钩吻生品（S10）、蒸制钩吻（不加胆汁混合蒸制）、蒸制猪胆粉（不加钩吻混合蒸制）及与钩吻生品等质量胆钩吻（PS10）粉末，加10 倍水浸泡30 min，煎煮60 min，旋转蒸发浓缩至浓度为0.2 g/mL，分别为钩吻水煎液、蒸制钩吻水煎液、蒸制猪胆粉水煎液、胆钩吻水煎液，临用前稀释成要求的浓度。

2.5.2 钩吻生品与胆钩吻急性毒性实验

2.5.2.1 钩吻完全致死量筛选 取清洁级ICR 小鼠，雌雄各半，体质量为18～22 g，随机分组。每组4只，给药前禁食12～6 h，自由饮水后按照10 mL/kg体质量分别灌服0.010 0、0.012 5、0.020 0、0.025 0、0.050 0、0.100 0、0.200 0 g/mL 钩吻水煎液（对应剂量分别为：0.100 0、0.125 0、0.200 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0、2.000 0 g/kg），观察小鼠死亡率，结果见图7。图7 显示：当钩吻水煎液剂量≥0.200 0 g/kg 时，小鼠死亡率为100%，存活时间多在0.4 h 内，确定S10钩吻水煎液的完全致死量为0.200 0 g/kg。

图7 钩吻生品不同剂量生存曲线

2.5.2.2 急性毒性实验 取清洁级ICR 小鼠80 只，雌雄各半，体质量为18～22 g，随机分为空白对照组、钩吻水煎液组、蒸制钩吻水煎液组、蒸制猪胆粉水煎液组、胆钩吻水煎液组，每组8 只，雌雄各半，给药前禁食12～16 h，自由饮水。按0.01 mL/g 体质量灌胃，观察14 d 内小鼠死亡情况，见表1。在同等剂量下，钩吻水煎液组小鼠约在10～30 min 出现中毒症状继而呼吸衰竭而亡，死亡率100%，胆钩吻水煎液组14 d 内死亡率为0%。胆钩吻水煎液组剂量提高到4.00 g/kg（按钩吻生药量计）时，14 d 内死亡率仍为0%，与钩吻水煎液组比较，安全范围约提高20 倍。

表1 钩吻与胆钩吻急性毒性比较

3 讨 论

钩吻具有抗肿瘤、抗感染等功效，但毒性亦备受争议。前期研究指出高温炮制过程钩吻吲哚生物碱发生氧化降解或转化，促使生物碱含量降低而达到减毒效果［16］。故本研究通过以猪胆汁对钩吻进行炮制，对比钩吻生品，可明显发现胆钩吻外观性状发生显著变化，其颜色由黄棕色变为黑褐色，略带腥味，应是加入胆汁炮制产生系列化学变化所致。

通过对10 批钩吻生品及胆钩吻的指纹图谱研究发现：胆汁炮制前后，钩吻生品及胆钩吻保留有大部分共有峰，但亦有部分峰消失，或是新的峰出现，指纹图谱可实现二者区分；胆汁炮制后识别的7 种钩吻生物碱成分峰面积均大幅度降低，包括毒性最强的钩吻素己，同时伴随新的峰生成。这可能与胆汁中某种/类物质与钩吻生物碱相互作用发生物理、化学变化，促使二者发生结合/转化，进而降低生物碱含量。结合HCA、PCA、OPLS-DA 等多元统计分析，发现钩吻素子、钩吻素己、胡蔓藤碱乙3个成分可作为胆钩吻炮制的差异标志物。故本研究建立的指纹图谱的对照图谱可作为后续钩吻生品与胆钩吻样品区分及质量一致性评价的参照。且通过指纹图谱与多元化统计分析相结合的方法，筛选得到的钩吻生品与胆钩吻差异性标志物可为胆钩吻的炮制质量标准提供参考。

胆钩吻急性毒性研究发现钩吻水煎液毒性强烈，剂量在0.20 g/kg 时，受试小鼠全部死亡；而胆钩吻水煎液组以钩吻水煎液完全致死量（0.20 g/kg）及完全致死量的20 倍（4.00 g/kg）灌服时，均未见受试小鼠死亡。胆钩吻水煎液组小鼠中毒后没有出现明显的痉挛、惊厥、跳跃等中毒表现，仅表现出安静、眯眼等反应，这一现象或与钩吻镇静催眠作用有关，提示胆汁混合蒸制能显著降低钩吻毒性，且可能保留有钩吻良好的药效。但本研究尚未深入进行探讨，后续将进一步展开研究。

本研究结果表明钩吻生品与胆钩吻指纹图谱差异显著，毒性生物碱成分含量降低，其毒性大大降低。本研究中胆汁用量为钩吻4 倍，受限于研究技术，并未对胆汁成分进行深入研究，这亦是目前胆汁炮制类中药研究不足之处。但根据本研究所建立HPLC 方法对胆汁提取物进行分析，色谱峰信息较少，对钩吻成分不产生干扰。此外，本研究亦尚未对胆钩吻其他方面的毒性及药效进行研究，后续将进一步深入研究。本研究重点突出钩吻生品与胆钩吻指纹图谱变化及毒性的变化，初步揭示胆汁混合蒸制使钩吻成分发生变化/转化是胆钩吻减毒的作用机制，为探索钩吻减毒存效策略提供新的方向，促进钩吻临床安全应用，也进一步丰富中药胆汁炮制理论内容。