LXR激动剂TO901317抑制N2a/APP695swe细胞内Aβ生成的机制研究*

黄 杰，张 雄，邓 煜，陈 非，罗英茂，田茗源

(1.重庆市精神卫生中心老年科 400036；2.重庆医科大学基础医学院 400016；3.重庆医科大学附属第二医院内分泌科 400010)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是最常见的神经退行性变性疾病，是痴呆的最主要的类型，其临床表现为进行性的认知功能障碍和记忆力损伤，而病理变化则是以细胞外β淀粉样蛋白(Aβ)增多并沉积形成老年斑、细胞内Tau蛋白过度磷酸化形成神经原纤维缠结(NFTs)和神经元丢失为主。其中，Aβ的产生及沉积形成老年斑是AD发生的关键[1]。在AD患者的脑内，Aβ生成的增多通常是由淀粉样前体蛋白(APP)依次经β-分泌酶(BACE1)和γ-分泌酶裂解导致。BACE1是Aβ生成的关键酶，主要位于细胞膜上胆固醇富集区，如脂筏(lipid raft)。而脂筏是质膜上富含胆固醇和神经鞘脂的动态微结构区域，其上分布着大量的膜蛋白受体，参与了信号转导[2]、物质转运等过程[3]，也与神经突触可塑性有着密切的关系[4]，其标志蛋白之一是小凹蛋白-1(caveolin-1)。研究表明，细胞内胆固醇水平可调节APP的加工，增强BACE1活性，促进Aβ生成，因此，抑制胆固醇合成和降低细胞内胆固醇水平将改变脂筏的构成，进而减少Aβ的生成[5]。

脑是富含胆固醇的器官，神经元中过多的胆固醇不能直接排到血液中，而是靠三磷酸腺苷结合盒转运子A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)胆固醇跨膜转运体系来促进胆固醇的外排，减少其对神经元产生的毒副作用。ABCA1跨膜转运体系是以ABCA1为核心，以贫脂的载脂蛋白[如载脂蛋白A1(apoA1)、高密度脂蛋白(HDL)]为受体，并主要以肝脏X受体(liver X receptor，LXR)和视黄醇类X受体(retinoic X receptor，RXR)的联合调控介导细胞内游离胆固醇和磷脂偶联后向外转运，进而降低细胞内胆固醇水平。一系列报道都显示，ABCA1跨膜胆固醇转运体系在Aβ的沉积及清除中发挥了重要作用[6-7]，这为开发防治AD的药物提供了新靶点[8]。研究证实，LXR受体可防止记忆衰退，延缓AD的发展，但机制尚不清楚[9-10]。因此，本实验采用LXR激动剂TO901317处理稳定表达APP的N2a/APP695swe细胞，检测TO901317对细胞内β淀粉样蛋白42(Aβ42)的影响，以及脂筏标记蛋白caveolin-1、APP和BACE1在mRNA和蛋白水平的表达情况，为AD的防治提供新的实验依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验细胞

小鼠来源的神经瘤母细胞(N2a细胞)由厦门大学许华曦教授提供，分为两种类型：野生型细胞(N2a/wt细胞)、稳定转染Swedish家族型突变的人APP695细胞(N2a/APP695swe细胞)。

1.1.2主要试剂

DMEM高糖培养基、Opti-MEM培养基、青-链霉素和0.25%胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司；LXR激动剂TO901317购自美国Sigma-Aldrich公司；G418购自Biosharp公司上海分公司；Aβ42 ELISA检测试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司；Trizol细胞裂解液购自美国Invitrogen公司；实时荧光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)试剂盒购自美国Promega公司；总蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白浓度检测试剂盒、苯甲基磺酰氟(PMSF)和RIPA蛋白裂解液均购自上海碧云天生物技术有限公司；除了内参β-actin和辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购自北京博奥森生物技术有限公司外，其余所有抗体均购自英国Abcam公司；电化学发光(ECL)试剂盒购自美国Millpore公司。

1.2 方法

1.2.1配置培养基

N2a/APP695swe细胞培养基：称取G418粉剂40 mg溶于10 mL DMEM中，过滤后加入84 mL DMEM、94 mL Opti-DMEM、10 mL胎牛血清、2 mL青链霉素，共配制200 mL培养基；N2a/wt细胞培养基：94 mL DMEM、94 mL Opti-DMEM、10 mL胎牛血清、2 mL青-链霉素，以上液体按比例配制好后放入4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2细胞培养和TO901317处理

将N2a/APP695swe细胞和N2a/wt细胞复苏后，贴壁生长于上述配置的培养基中，置37 ℃ 5% CO2湿度饱和的培养箱中培养。将TO901317溶于DMSO∶磷酸盐缓冲液(PBS)为1∶3的溶液中，形成浓度分别为5、10和20 μmol/L的TO901317混合溶液，然后加入N2a/APP695swe细胞培养瓶中，以N2a/wt细胞作为对照。

1.2.3ELISA检测细胞Aβ42浓度

各组细胞(N2a/wt组、N2a/APP695swe组、DMSO对照组，以及经5、10和20 μmol/L TO901317处理N2a/APP695swe细胞的各TO901317处理组)经胰蛋白酶消化离心后收集上清液，加入20 μL Protease Inhibitor Cocktail Set 1，至终浓度为1 mmol/L，以防一系列蛋白酶降解Aβ，分装保存于-20 ℃。做好试剂和标准品的制备工作后，按照说明书进行操作：取出96孔板，加入标准品、待测样品后，再加入50 μL Aβ42检测抗体，同时设空白对照组，橡皮膏条封存，置室温3 h；洗涤4遍，甩掉板中液体后用吸水纸吸干，加入100 μL兔抗IgG-HRP工作液，封存并置室温30 min；吸干水分后再加入100 μL稳定液，封存，置室温30 min；再加入100 μL终止液，终止显色，用酶标仪在450 nm波长下读取吸光度(A450)值，然后根据标准曲线计算出Aβ42的浓度。

1.2.4RT-PCR检测细胞caveolin-1、BACE1与APP mRNA水平

各组细胞(N2a/wt组、N2a/APP695swe组、DMSO对照组、20 μmol/L TO901317处理组)经胰蛋白酶消化离心弃上清液，用Trizol法提取总RNA。β-actin：正向5′-GCC ATG TAC GTA GCC ATC CA-3′，反向5′-GAA CCG CTC ATT GCC GAT AG-3′；APP mRNA：正向5′-GGT GGC TGA GGA GAT TCA AG- 3′，反向5′-ATG AGA GCG TCG TTT CCG TA- 3′；BACE1 mRNA：正向5′-GGC GGG AGT GGT ATT ATG AA-3′，反向5′-GTG ATG CGG AAG GAC TGA TT-3′；caveolin-1：正向5′-TAT GAC GCG CAC ACC AAG GA-3′，反向5′-GCC CAG ATG TGC AGG AAG GA-3′。反应体系：Go Taq Green Master Mix 12.5 μL，逆转录产物(cDNA)2.5 μL，下游引物1 μL，上游引物1 μL，无核酸酶水8 μL，总体积 25 μL。PCR反应步骤：预变性94 ℃ 3 min；变性94 ℃ 30 s；退火58 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 45 s。

1.2.5Western blot检测细胞caveolin-1、BACE1与APP水平

各组细胞(N2a/wt组、N2a/APP695swe组、DMSO对照组、20 μmol/L TO901317处理组)经胰蛋白酶消化离心弃上清液，加入1 mL RIPA蛋白裂解液，充分裂解后于4 ℃，13 000 r/min离心15 min后，用Bradford法测定每组蛋白样品浓度并分装保存。配置8%～10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)胶，上样50 μg经十二烷基硫酸钠-PAGE(SDS-PAGE)，将蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，然后置入TBST缓冲液稀释的抗体caveolin-1、APP、BACE1和内参β-actin，4 ℃孵育过夜；充分洗涤后加入1∶5 000的HRP标记的羊抗兔二抗，室温孵育2 h，最后用ECL试剂盒行曝光显影，经Bio-rad Chemical Dox XRS凝胶成像系统进行条带的分析。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 TO901317降低了N2a/APP695swe细胞内Aβ42的生成

ELISA结果显示：正常N2a/wt细胞(N2a/wt组)上清液中分泌的Aβ42为(1.33±0.33)ng/mL，低于N2a/APP695swe细胞(N2a/APP695swe组)的(3.78±0.31) ng/mL，以及DMSO处理后的N2a/APP695swe细胞(DMSO对照组)生成的Aβ42水平(3.67±0.28) ng/mL，差异均有统计学意义(P<0.01)。经5 μmol/L TO901317处理后，细胞上清液中生成的Aβ42水平为(3.55±0.34)ng/mL，与N2a/APP695swe组和DMSO对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；随着TO901317处理浓度增加至10、20 μmol/L，细胞内Aβ42水平下降至(2.96±0.23)、(2.54±0.16)ng/mL，与N2a/wt组和N2a/APP695swe组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)，且具有浓度-依赖性，见图1。

1：N2a/wt组；2：N2a/APP695swe组；3：DMSO对照组；4：5 μmol/L TO901317处理组；5：10 μmol/L TO901317处理组；6：20 μmol/L TO901317处理组；a：P<0.01，与N2a/wt组比较；b：P<0.01，与N2a/APP695swe组比较。

2.2 TO901317对N2a/APP695swe细胞内caveolin-1、BACE1和APP mRNA水平的影响

RT-PCR结果表明：与N2a/wt组细胞比较，N2a/APP695swe组细胞内caveolin-1 mRNA表达水平明显降低(P<0.01)，BACE1和APP mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。N2a/APP695swe细胞经DMSO处理后(DMSO对照组)，细胞内caveolin-1、BACE1和APP mRNA表达水平与N2a/APP695swe组比较无明显差异(P>0.05)；而经20 μmol/L TO901317处理后，N2a/APP695swe细胞中caveolin-1 mRNA表达水平较N2a/APP695swe组明显升高(P<0.01)，BACE1和APP mRNA表达水平较N2a/APP695swe组明显下降(P<0.01)，见图2。

1：N2a/wt组；2：N2a/APP695swe组；3：DMSO对照组；4：20 μmol/L TO901317处理组；a：P<0.01，与N2a/wt组比较；b：P<0.01，与N2a/APP695swe组比较。

2.3 TO901317对N2a/APP695swe细胞内caveolin-1、BACE1和APP水平的影响

Western blot结果表明：与N2a/wt组细胞比较，N2a/APP695swe组细胞内caveolin-1表达水平明显降低(P<0.01)，BACE1和APP表达水平明显升高(P<0.01)。经DMSO处理后，N2a/APP695swe细胞内(DMSO对照组)caveolin-1、BACE1和APP表达水平与N2a/APP695swe组比较无明显差异(P>0.05)；而经20 μmol/L TO901317处理后，N2a/APP695swe细胞中caveolin-1表达水平较N2a/APP695swe组明显升高(P<0.01)，BACE1和APP表达水平较N2a/APP695swe组明显降低(P<0.01)，见图3。

A：各组细胞内caveolin-1、BACE1和APP表达情况；B：N2a/APP695swe细胞内caveolin-1、BACE1和APP表达的相对A450值统计柱状图；1：N2a/wt组；2：N2a/APP695swe组；3：DMSO对照组；4：20 μmol/L TO901317处理组；a：P<0.01，与N2a/wt组比较；b：P<0.01，与 N2a/APP695swe组比较。

3 讨 论

AD是常见的痴呆类型，其发病机制尚不完全清楚。Aβ在脑组织中生成过度或清除障碍都可能引起Aβ的沉积并形成老年斑，这是诱发AD的共同通路，也是目前公认的AD的关键致病因素。因此，寻找抑制Aβ产生的药物成为防治AD的重要研究方向。

Aβ由APP剪切而来，其方式有α-分泌酶剪切途径和BACE1剪切途径[11]。通常情况下，只有少部分α-分泌酶的小片段位于脂筏内，其绝大部分片段则位于含胆固醇极低的非脂筏区。而BACE1和γ-分泌酶都存在于富含胆固醇的脂筏区。当细胞内胆固醇水平升高时，α-分泌酶发生了移位，从非脂筏区移至膜上脂筏区，这一位置的改变不仅增加了α-分泌酶对APP的剪切，还促进了BACE1的糖基磷酸化，进而显著提高γ-分泌酶的活性，最终促进了Aβ的生成[12]。在本实验中，体外培养稳定表达APP的N2a/APP695swe细胞，结果显示在该细胞内脂筏亚结构域质膜微囊标志性蛋白caveolin-1表达较弱，而APP和BACE1表达水平较高，产生的Aβ42更多。

研究表明，胆固醇水平与生成的Aβ水平呈正相关；降低体内胆固醇水平会减少Aβ生成[5]。胆固醇的外排主要通过两个途径：B类Ⅰ型清道夫受体(SRBI)跨膜转运体系、ABCA1跨膜转运体系。前者经证实在AD神经元的胆固醇外流转运中未发挥关键作用[13]，而后者则通过LXR/RXR的联合调控，介导细胞内游离胆固醇和磷脂偶联后向外转运，与AD的发生、发展密切联系。RIDDELL等[14]利用LXR激动剂TO901317处理转基因鼠Tg2576后，发现小鼠海马区Aβ沉积显著减少，记忆能力也增强。美国匹兹堡大学的FITZ等[15]也使用TO901317处理APP转基因小鼠，结果显示TO901317促进了高脂饮食饲喂转基因小鼠大脑组织中Aβ的清除，并改善了小鼠的认知功能，但其机制并未阐明。在本研究中也发现，TO901317处理N2a/APP695swe细胞后，细胞内的Aβ42生成减少，且呈浓度依赖性；进一步发现，TO901317处理后，N2a/APP695swe细胞内的caveolin-1表达增强，而APP和BACE1表达则降低。

综上所述，在AD的发生、发展过程中，胆固醇的转运障碍导致了脂筏的构成发生改变，进而引起脂筏上与Aβ生成密切相关的关键蛋白的增加。而LXR激动剂TO901317能通过激活LXR启动胆固醇的外排过程，改善脂筏的构成(增强caveolin-1的表达)，从而抑制脂筏上APP和BACE1的募集，进而阻碍APP的剪切，最终抑制Aβ的生成。