60种中草药及其复方对杀鱼爱德华氏菌的体外抑菌效果

2022-07-04胡建美王宝屯冯娟许新苏友禄

甘肃农业大学学报 2022年2期

胡建美，王宝屯，冯娟，许新，苏友禄

(1.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306；2.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东广州 510300；3.仲恺农业工程学院健康养殖创新研究院，广东广州 510225；4.广州市从化区农业农村局，广东广州 510900)

中国是世界第一水产养殖大国，但在工业化养殖的过程中由于鱼类病害频发，造成了巨大的经济损失[1]。为有效防治养殖过程中病害的发生，水产疫苗[2-4]、抗生素[5]和益生菌[6]等都是常见的防治手段。在取得成效的同时，由于抗生素等化学药品的滥用，导致水环境变差，动物产生耐药性，使治疗成本不断提高[7]；同时这些物质在水产品体内富集，也会危害动物和人类健康。因此，开发能有效防治病害且对环境友好的药物对水产养殖具有重要意义。

中草药作用机理复杂，病原体难以产生抗性；中草药应用在水环境中，易分解，停留时间短；中草药价格相对低廉，可有效降低成本；中草药除直接作用于病原体外，还可增强动物机体免疫力，达到防优于治的效果[8]。中草药中含有生物碱、有机酸、萜类、氨基酸和多糖等生物活性成分，可达到清热解毒、抗菌、杀菌、促进生长发育和提高机体免疫力等多种功效，对细菌性、病毒性、真菌性和寄生虫等疾病有效[9]。中草药泼洒在水体中，可达到杀菌、抗病毒和优化菌群组成等作用；中草药拌饲后投喂，作为饲料添加剂可促进生长和提高机体免疫功能[10]。

花鲈(Lateolabraxmaculates)隶属于鲈形目，又称七星鲈、花寨、中国花鲈。据中国渔业年鉴统计，2020年鲈鱼产量位居中国海水鱼第3，约为18万t，主要产自广东、福建和山东等地[11]。花鲈的大规模、高密度工业化养殖，加剧了养殖过程中各种病害的发生，其中哈维弧菌(Vibrioharveyi)[12]、维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)[13]和杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiellapiscicida)[14]等是花鲈的主要病原菌，给花鲈的养殖产业造成一定的经济损失。

杀鱼爱德华氏菌为2013年通过表型和遗传特性鉴定后从迟缓爱德华氏菌(Ewardsiellatarda)中分离出的爱德华氏菌属(Edwardsiella)新种[15]，它广泛存在于环境和宿主体内，可通过皮肤、鳃、肠道等多种途径感染经济鱼类，引发爱德华氏菌病(Edwardsiellosis)，并最终导致鱼类大量死亡。此病菌在世界各地均有发现，宿主范围广泛，多为海水和咸淡水鱼类，包括大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、花鲈和日本鳗鲡(Anguillajaponica)等，可引起鱼类系统性的出血性败血症，导致鱼体行动缓慢，缺氧而死，以及内部脏器充血、出血以及发生坏死[16]。杀鱼爱德华氏菌的致病性和它含有的多种毒力因子紧密相关，例如：细胞黏附素、溶血素、脂多糖、III 型分泌系统(Type III secretion system，T3SS)和VI 型分泌系统(Type VI secretion system，T6SS)等，目前对T3SS和T6SS研究较为深入[17]。杀鱼爱德华氏菌是胞内病原体，该菌的致病机制、耐药性和疫苗开发备受关注[18]。

目前治疗该病的主要方法是化学药物，四环素类和磺胺类药物对治疗杀鱼爱德华氏菌病有较好的效果，但同时也导致耐药细菌的流行，因此，需要开发新型环境友好的治疗方法。中草药因其具易分解、不残留和价格低廉等优点使其成为该病害防控的优选。本文通过研究60种常见且价格低廉的中草药对杀鱼爱德华氏菌的体外抑菌、杀菌作用，以期为中草药药物开发和杀鱼爱德华氏菌病的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

杀鱼爱德华氏菌18BJ136，为本课题组于珠海市花鲈养殖场分离、鉴定并保存的[16]。

1.2 试验药物及培养基

选取生活中常见且价格低廉的中草药，分别为：分心木(Semenjuglandis)、石榴皮(Punicagranatum)、番石榴叶(Psidiumguajava)、绵茵陈(Artemisiascoparia)、半枝莲(Scutellariabarbata)、青蒿(Artemisiaannua)、乌梅(Fructusmume)、柏子仁(Platycladusorientalis)、野菊花(Dendranthemaindicum)、蒲公英(Taraxacummongolicum)、大黄(Rheumpalmatum)、地榆(Sanguisorbaofficinalis)、五种子(Schisandrachinensis)、竹茹(Bambusatuldoides)、紫苏叶(Perillafrutescens)、穿心莲(Andrographispaniculata)、延胡索(Corydalisyanhusuo)、鸡骨草(Abruscantoniensis)、地骨皮(Lyciumchinense)、吴茱萸(Euodiarutaecarpa)、鹿含草(Pyrolacalliantha)、决明子(Cassiasemen)、虎杖(Reynoutriajaponica)、槟榔(Arecacatechu)、荆芥(Nepetacataria)、淡竹叶(Lophatherumgracile)、麦芽(Hordeurnvulgar)、香加皮(Periplocasepium)、银柴胡(Stellariadichotoma)、丁香(Syzygiumaromaticu)、苦地丁(Corydalisbungeana)、马齿苋(Portulacaoleracea)、金银花(Lonicerajaponica)、天花粉(Trichosantheskirilowii)、板蓝根(RadixIsatidis)、苍术(Atractylodeslancea)、紫花地丁(Violayedoensis)、黄芩(Sastellariabaicalensis)、鱼腥草(Houttuyniacordata)、白薇(Cynanchumatratum)、络石藤(Trachelospermumjasminoides)、芦荟(Aloevera)、八角茴香(Illiciumverum)、金钱草(Lysimachiachristinae)、五倍子(Gallachinensis)、黄柏(Phellodendronchinense)、合欢花(Albiziajulibrissin)、甘草(Glycyrrhizauralensis)、柿蒂(Diospyroskaki)、牛蒡子(Arctiumlappa)、浮萍(Lemnaminor)、谷芽(Setariaitalica)、白芍(Paeonialactiflora)、槐花(Sophorajaponica)、天冬(Asparaguscochinchinensis)、白前(Cynanchumglaucescens)、仙鹤草(Agrimoniapolosa)、黄芪(Astragalusmembranaceus)和小茴香(Nepetatenuifolia)，共60种传统中草药为研究对象，供试中草药购自广东省珠海市斗门区某药房。

脑-心浸萃液态培养基(brain heart infusion borth，BHI)和技术琼脂粉(agar powder)购自广东环凯微生物科技有限公司。BHI液体培养基的配置：37 g BHI培养基粉末溶于1 L 纯水中，121 ℃灭菌20 min后使用。BHI琼脂平板的配置：37 g BHI培养基粉末和15 g技术琼脂粉溶于1 L 纯水中，121 ℃灭菌20 min后取出，于50 ℃左右倒板。

1.3 中草药水提液的制备

将上述中草药置于60 ℃烘干后粉碎，分别称取质量为100 g的中草药，纱布包裹，注入500 mL纯水，浸泡2 h，武火煮沸后，文火熬制30 min，4层纱布过滤，重复两次，收集滤液。提取液在水浴锅内95～100 ℃下常压蒸发浓缩至100 mL，121 ℃灭菌20 min，置于4 ℃保存。得到终质量浓度为1 000 mg/mL的中草药水提液。

根据药物特性及养殖生产实践中复方中药治疗细菌病的研究报道，复方中药水提液按质量比1∶1配比[19]，即分别称取两种中草药各50 g，后续置备和上述一致。

1.4 杀鱼爱德华氏菌菌悬液的制备

杀鱼爱德华氏菌18BJ136活化于BHI琼脂平板上，28 ℃培养24 h，挑取长势良好的单菌落于BHI液体培养基内，28 ℃、200 r/min，过夜培养，调节菌液浓度为1×108cfu/mL，作为试验菌液。

1.5 抑菌圈的测定

采用平板打孔法[20]测定单方中草药抑菌圈大小，取浓度为1×108cfu/mL的杀鱼爱德华氏菌悬液涂布于BHI琼脂平板后，使用孔径7 mm的无菌打孔器，每个平板培养基内设置4孔，其中3孔为实验组生物学重复，每个实验孔内加入0.1 mL中草药水提液，保持加满而不溢出的状态；第4孔为阴性对照，内为无菌水。将平板正置于恒温培养箱内，28 ℃培养24 h。选取3个不同角度测量抑菌圈直径大小。

最终判定标准[21]为：抑菌圈直径>20 mm，极度敏感(++++)；抑菌圈直径15～20 mm，高度敏感(+++)；抑菌圈直径10～15 mm，中度敏感(++)；抑菌圈直径<10 mm，低度敏感(+)；无抑菌圈则不敏感(-)。

1.6 单方中草药最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定

根据二倍稀释法[20]，测定抑菌效果良好的中草药水提液的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。具体操作如下：对10支12 mL的无菌试管进行编号，依次为1～10；每支试管内加入等量BHI液体培养基，随后往第1支试管内加入与液体培养基等量的中草药水提液，编号1～8号管按顺序进行2倍稀释，则试管内中草药质量依次为原液浓度的1/2、1/4、1/8、…、1/256；1～9号管中分别加入10 μL菌悬液，其中第9管为不给药只含培养基的阳性对照，第10管为不给药不加菌液的阴性对照。设置3组生物学重复。为便于试验结果的比较和观察，同时设置一组不添加菌液的药物稀释组。28 ℃、200 r/min培养24 h后，观察结果。其中按顺序出现的最后一支澄清透亮试管的稀释质量浓度为该药物的MIC。

根据MIC结果，取稀释质量浓度为MIC值及高于该浓度培养物各100 μL涂布于BHI琼脂平板上，28 ℃培养24 h，观察试验结果，无菌生长中最低质量浓度为该药物的MBC。

1.7 复方中草药MIC和MBC的测定

依据单方中草药对杀鱼爱德华氏菌的药敏试验结果，选取其中部分中药进行复方试验，测定不同组合下的复方中草药对杀鱼爱德华氏菌的MIC和MBC，操作步骤参照1.5。判断复方中草药之间相互作用的关系指标为：复方中草药联合抑菌指数[22](faction inhibitory concentration index，FICI)=甲药联合时MIC/甲药单独时MIC+乙药联合时MIC/乙药单独时MIC，判定标准：FICI≤0.5，判为协同作用；0.52，判为拮抗作用。

2 结果与分析

2.1 60种单方中草药对杀鱼爱德华氏菌的体外抑菌效果

杀鱼爱德华氏菌对60种中草药中的14种表现为敏感，其中对苏木极度敏感(++++)，抑菌圈直径为21.94 mm；对分心木、石榴皮和番石榴叶高度敏感(+++)，抑菌圈直径分布在15～20 mm之间；对绵茵陈、半枝莲、青蒿、乌梅、柏子仁、野菊花和蒲公英表现为中度敏感(++)，抑菌圈直径范围在10～15 mm；对大黄、地榆和五种子低度敏感(+)，抑菌圈直径小于10 mm(表1)。对竹茹、紫苏叶、穿心莲、延胡索、紫花地丁、浮萍、天冬和小茴香等46种中草药不敏感(-)(表1)。

表1 60种中草药对杀鱼爱德华氏菌体外抑菌效果

2.2 4种复方中草药对杀鱼爱德华氏菌的体外抑菌效果

在复方中药中，杀鱼爱德华氏菌对苏木+半枝莲表现为极度敏感(++++)，抑菌圈直径为20.13 mm；对地榆+乌梅表现为高度敏感(+++)，抑菌圈直径在为19.13 mm；对乌梅+苏木和半枝莲+地榆复方中度敏感(++)，抑菌圈直径为10～15 mm(表2)。

表2 4种复方中药对杀鱼爱德华氏菌体外抑菌效果

2.3 单方中草药对杀鱼爱德华氏菌的MIC和MBC

柏子仁的MIC和MBC均为500 mg/mL；野菊花、大黄、苏木、地榆、五倍子和番石榴叶六种药材的MIC为250 mg/mL，MBC在125～500 mg/mL之间不等；青蒿、分心木和绵茵陈的MIC为125 mg/mL，其中绵茵陈和分心木的MBC为250 mg/mL，青蒿的MBC为125 mg/mL；蒲公英和乌梅的MIC和MBC，分别为31.25 mg/mL和62.5 mg/mL。

表3 中草药对杀鱼爱德华氏菌最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

2.4 4种复方中草药对杀鱼爱德华氏菌的MIC和MBC

由表4可知，不同组合的复方中草药对杀鱼爱德华氏菌的体外抑菌作用差异较大。乌梅+苏木、半枝莲+地榆和地榆+乌梅的MIC为125 mg/mL，前2个组合的MBC为250 mg/mL，后者为125 mg/mL，4种复方组合的FICI均大于2；苏木+半枝莲的MIC为31.25 mg/mL，MBC为125 mg/mL。根据FICI结果显示，所有复方组合中两种联合用药的中草药均为拮抗关系。

表4 复方中草药对杀鱼爱德华氏菌最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

3 讨论

中草药作为一种天然药物，具有安全、高效、残留少且价格低廉等诸多优点；它的抑菌活性是源于体内的有机酸、糖类、生物碱、苷类和挥发油等免疫活性物质和丰富的营养物质，相互结合，促进新陈代谢和提高免疫力，最终达到促生长、抗细菌、抗病毒、消炎和防治病害的效果[23]。由试验结果可知，石榴皮、乌梅、蒲公英和半枝莲的水提物对杀鱼爱德华氏菌具有强大的杀菌作用，但吴颖瑞等[24]研究发现，4种药物的乙醇提取物对罗非鱼源的无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)和海豚链球菌(Streptococcusiniae)并无抑制活性，其原因可能是由于同种中草药在不同种细菌间的抑菌效果存在差异，或者不同的提取方法导致中草药药效有所差异所致[25]。从抑菌圈结果可知，杀鱼爱德华氏菌对苏木极度敏感，但在随后的MIC和MBC的测定中发现：苏木需要在较高的浓度下，才能达到一定的抑菌、杀菌效果。推测原因，可能存在一临界值，苏木的浓度只有达到临界值时，其抑菌、杀菌效果才会出现质的飞跃。

石榴皮、乌梅、蒲公英和半枝莲均具有清热解毒、抗菌消炎、抗病毒、抗肿瘤，降低血糖、血脂等价值[26]。蒲公英对革兰氏阴性和阳性菌都具有较强的抑制作用，其中对鮰爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)的抑菌效果较好，抑菌圈大于20 mm，MIC和MBC可达7.5 mg/mL[27]；其水提物对迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)抑菌效果显著[28]。本试度验中，蒲公英对杀鱼爱德华氏菌同样具有明显的抑菌作用，表明蒲公英对爱德华氏菌属细菌具有较好的抑菌作用。蒲公英抑菌效果是黄酮、多酚及生物碱等有效活性物质抗菌、消炎等药理活性的体现，主要作用机制为抑制细胞壁合成及胞内DNA和蛋白质合成[29]；此外，蒲公英内生真菌对鱼源病原菌具有体外抑菌作用，表明其抑菌成分的来源具有多样性[30]。

乌梅和石榴皮是药食同源的药材，临床功效广泛。对不同细菌，乌梅抑菌效果存在差异，例如：乌梅对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠埃希菌(Escherichiacoli)和沙门菌(Salmonellaspp.)抑菌效果良好，其中对沙门菌的抑菌圈直径可达41.98 mm；但在对溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)的体外抑菌实验中，需要较高的质量浓度才可达到较为显著的效果[29]。石榴皮对弧菌属(Vibrospp.)、气单胞菌属(Aeromonasspp.)和爱德华氏菌属等[31]均具有较好的抑菌、杀菌效果，可见石榴皮对不同种属的细菌都有抗菌效果，具有广谱抗菌性。在本试验中，乌梅和石榴皮对杀鱼爱德华氏菌表现出良好的抑菌作用，这与乌梅和石榴皮的抗菌机制密切相关。有研究表明，乌梅和石榴皮具相同抑菌机制，表现为破坏现有细胞结构的完整性、抑制胞内重要物质合成，阻滞细胞繁殖传代途径；但不同的是，石榴皮还可干预细胞的己糖磷酸途径，对细胞的生理生化进程具有更精准的影响作用[32-33]。采用琼脂法测定中草药对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的体外抑菌试验发现，石榴皮和乌梅的抑菌效果一般[34]；与之相反，有研究发现石榴皮和乌梅对迟缓爱德华氏菌抑菌效果明显[35]；也有研究发现乌梅对嗜水气单胞菌的抑菌效果较强[36]。综上所述，乌梅和石榴皮对杀鱼爱德华氏菌具有显著抑菌作用，但不同提取方法对中草药抑菌效果有一定影响[25,31]；此外，同种中草药对不同地区分离的同种细菌间的抑菌、杀菌效果也存在一定的差异。

由于复方中草药由多种药材构成，化学成分复杂，抑菌效果较单方中草药更佳，与单方相比可对不同细菌或同种细菌的不同菌株表现出更好的抑菌效果[37]。中草药复方制剂在体外表现出抑菌、杀菌效果的同时，对水产养殖动物也具有良好的促生长、抗病和增强免疫等积极作用[23]。本研究中，苏木+半枝莲等4种复方中草药对杀鱼爱德华氏菌高度敏感，抑菌和杀菌作用可以在较小浓度下实现；当药物质量浓度达到250 mg/mL时，杀鱼爱德华氏菌对4种复方极度敏感，无法存活；然而，在单方中草药为500 mg/mL的浓度下，苏木和地榆才能杀菌，以上结果表明单方和复方的抑菌效果可能存在差异[38]，两种或多种草药中含有的丰富的活性物质可以更好地实现抑菌杀菌功效。然而，除了药物之间成分、含量的差异外，中草药煎煮方法，以及产地、储存方式等因素，也会影响药效的发挥[39]。