EZH2抑制剂GSK343对脑胶质瘤细胞EZH2/STAT4/IFN-γ通路及γδT细胞杀伤作用的影响

夏丽琼， 杨明华， 谢 燕

(四川省绵阳市中心医院呼吸与危重症医学科， 四川 绵阳 621000)

脑胶质瘤为临床常见的颅内恶性肿瘤，常发生于神经外胚层，约占中枢神经系统肿瘤的40%左右[1]。由于脑胶质瘤生长迅速、侵袭性强、浸润能力强，患者的生存率较低，行手术切除辅助放化疗进行治疗无法避免手术创伤大、易复发、预后不良等问题[2]。近年来，免疫疗法在其他肿瘤治疗中取得进展，抗肿瘤特异性强，不良反应轻微，有望成为手术后的最佳辅助治疗方法。γδT细胞是具有特异性抗肿瘤活性的固有免疫T细胞，已应用于肿瘤的过继性细胞免疫治疗[3]。Zeste基因增强子人类同源物2(enhancer of Zeste homolog 2，EZH2)是一种甲基化酶，可通过甲基化修饰抑制抑癌基因的表达，进而调节细胞增殖[4]。信号转导与转录激活因子4(signal transducer and activator of transcription 4，STAT4)通路是重要的细胞因子信号转导通路，磷酸化后可诱导免疫细胞产生干扰素-γ(interferon gamma，IFN-γ)，在肿瘤细胞的免疫治疗中发挥重要作用[5]。GSK343是一种EZH2抑制剂，有研究显示，GSK343在癌症治疗领域具有良好的前景及临床价值[6]，但对脑胶质瘤及肿瘤免疫的作用鲜有研究。本研究将通过研究GSK343对脑胶质瘤U373细胞EZH2/STAT4/IFN-γ通路及γδT细胞杀伤作用的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器：U373(人脑胶质瘤细胞系)(货号：YS3679C)、胰蛋白酶(货号：9002-07-7)，上海彩佑；DMEM培养液(货号：ZY-P0032)，上海泽叶；胎牛血清(货号：S9030)、EZH2抗体(货号：Ezh2 Antibody)、p-STAT4抗体(货号：bs-3430R-2)、IFN-γ抗体(货号：BA3383-2)，上海恒斐；GSK343(货号：S81294)，上海源叶；CCK-8试剂(货号：QN1293-OIR)、AnnexinV-FITC/PI试剂盒(货号：WE0325-THR)，北京百奥莱博；MODEL550酶标仪及ChemiDocXRS化学发光成像系统，美国Bio-Rad；BD FACSCanto II流式细胞仪，美国BD。

1.2方 法

1.2.1细胞培养与分组：取出在液氮罐中冻存的人脑胶质瘤U373细胞，37℃水浴复苏，接种在DMEM培养液(含10%胎牛血清)，培养箱中培养，消化、传代。U373细胞接种96孔培养板(1×105个/mL)，每孔100μL，设置分组为：对照组(细胞正常培养，不做药物处理)和GSK343组(GSK343处理细胞)。

1.2.2CCK-8法检测各组U373细胞增殖：将对照组、GSK343组(分别用10μmoL/L、20μmoL/L、50μmoL/L和100μmoL/L GSK343处理细胞[7])U373细胞培养48h，加10μL CCK-8，37℃培养4h，酶标仪(450nm)测吸光度(optical density，OD)值，计算细胞增殖抑制率=(OD对照组-OD处理组)/OD对照组×100%[7]。

1.2.3流式细胞仪检测U373细胞凋亡：U373细胞培养48h，收集、消化、洗涤并调整为1×106个/mL，分别加入Annexin V-FITC、PI各5μL，1h避光孵育，流式细胞仪检测细胞凋亡率[7]。

1.2.4WB法检测EZH2、p-STAT4、IFN-γ蛋白表达情况：将对照组、GSK343组U373细胞培养48h，收集、提取总蛋白、定量。电泳分离蛋白、转PDVF膜、5%脱脂奶粉封闭1h，分别加入一抗EZH2抗体(1∶500)、p-STAT4抗体(1∶500)、IFN-γ抗体(1∶500)、GAPDH抗体(1∶500)，4℃过夜孵育，加羊抗兔二抗(1∶5000)，常温孵育1h，发光法显色，拍摄图像，分析条带灰度，目的蛋白相对表达量为目的蛋白与内参GAPDH的条带灰度值比值[7]。

1.2.5显微镜观察U373细胞形态：在对照组、GSK343组基础上按10∶1的效靶比加入100μL γδT细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司)，孵育24h后，倒置显微镜观察U373细胞形态。

1.2.6CCK-8法检测γδT细胞对U373细胞的杀伤作用：在对照组、GSK343组基础上按10∶1的效靶比加入100μL γδT细胞，同时分别设立相应的空白对照组、γδT细胞对照组和U373细胞对照组。孵育24h后，每孔加入CCK-8试剂20μL，继续孵育4h后，在酶标仪450nm处检测每孔OD值，计算杀伤活性。杀伤活性(%)=[1-(实验组OD值-γδT细胞对照组OD值)/(U373细胞对照组OD值-空白对照组OD值)]×100%[3]。

2 结 果

2.1GSK343对U373细胞增殖的影响：随着GSK343的处理及处理浓度的升高，U373细胞增殖抑制率逐渐升高，U373细胞的GSK343半数抑制浓度(50% inhibitory concentartion，IC50)处于20-50μmoL/L范围内，故选择50μmoL/L作为GSK343组的最佳处理浓度进行后续实验，见图1。

图1 各组U373细胞增殖抑制率

2.2GSK343对U373细胞凋亡的影响：与对照组相比，GSK343组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见图2。

图2 流式细胞仪检测GSK343对U373细胞凋亡的影响

2.3GSK343对U373细胞中EZH2、p-STAT4、IFN-γ蛋白表达的影响：GSK343组EZH2蛋白水平较对照组显著降低(P<0.05)，p-STAT4、IFN-γ蛋白水平较对照组显著升高(P<0.05)。见图3。

图3 WB检测GSK343对U373细胞中EZH2、p-STAT4、IFN-γ蛋白表达的影响

2.4GSK343对γδT细胞杀伤的U373细胞形态的影响：与对照组相比，GSK343组有更多的U373细胞呈现不规则长梭形、胞质肿胀的细胞形态，见图4。

图4 显微镜观察GSK343对γδT细胞杀伤的U373细胞形态的影响

2.5GSK343对U373细胞中γδT细胞杀伤作用的影响：各个时间点，与对照组相比，GSK343组γδT细胞对U373细胞的杀伤活性均显著升高(P<0.05)。见图5。

图5 各组γδT细胞对U373细胞的杀伤活性

3 讨 论

脑胶质瘤是颅内常见的肿瘤类型之一，起源于神经胶质细胞，其组织类型包括星形细胞瘤、胶质母细胞瘤等。脑胶质瘤的发病率、恶性程度均较高，严重威胁人类生命。而目前外科手术切除等治疗对脑胶质瘤患者生存率的改善作用并不显著。近年来，发现免疫治疗在肿瘤治疗中发挥重要作用，正逐渐受到人们关注。γδT细胞是一群存在于外周血、具备天然免疫和适应性免疫双重功能、可用于肿瘤免疫细胞治疗的T细胞亚群，其T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)由γ、δ链组成。但由于肿瘤细胞表面表达的为γδ细胞，其所识别的分子常常丢失，导致免疫逃逸发生，限制了γδT细胞免疫治疗肿瘤的效果[8]。因此，进一步研究影响脑胶质瘤细胞有关通路及γδT细胞杀伤作用的新靶点，可为脑胶质瘤防治提供参考。

EZH2是表观遗传调控基因，能够对组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基催化从而抑制靶基因的表达。Ma等[9]研究表明，EZH2抑制剂可诱导肿瘤细胞凋亡，并有效降低其迁移能力。Yi等[10]研究表明，EZH2在卵巢癌中呈上调表达，通过介导TIMP2表观遗传沉默促进卵巢癌的迁移和侵袭能力，且使用EZH2抑制剂抑制EZH2表达可激活TIMP2转录进而影响卵巢癌的迁移、侵袭过程。丁沐阳等[11]研究表明，EZH2抑制剂GSK343对宫颈癌细胞的增殖与迁移能力具有明显抑制作用。本研究结果显示，随着GSK343的处理及处理浓度的升高，U373细胞增殖抑制率逐渐升高，提示GSK343可呈浓度依赖性抑制脑胶质瘤细胞U373的增殖过程，并根据IC50将50μmoL/L GSK343作为处理U373细胞的最适浓度，并用于后续实验中。后续实验结果显示，使用GSK343后，U373细胞OD值显著降低，细胞凋亡率显著升高，细胞中EZH2蛋白表达水平显著降低，提示GSK343可抑制脑胶质瘤细胞中EZH2蛋白表达，抑制细胞增殖，并促进其凋亡，具有很好的肿瘤抑制作用，但具体作用途径尚需进一步研究。

免疫是消灭肿瘤细胞的重要调控方式，涉及多种免疫细胞及复杂的通路调控。STAT蛋白家族是由多个相同结构域构成的胞内蛋白质家族，激活后参与基因转录调控，在细胞发育、增殖和免疫防御中起重要作用[12]。STAT4是STAT蛋白家族成员之一，在子宫内膜癌组织中表达升高，并与患者的病理分期、肿瘤分化、肌层浸润、淋巴结转移及3年预后生存有关。沈娟等[13]研究表明，IL-12通过促进STAT-4的磷酸化恢复自然杀伤细胞细胞的免疫功能。IFN-γ是目前Ⅱ型干扰素家族中发现的唯一成员，由T细胞产生，具有直接抑制肿瘤细胞增殖、抗肿瘤血管、增加肿瘤表面主要组织相容性复合体抗原和肿瘤坏死因子表达生成等多种抗肿瘤作用。IFN-γ可增强原发性、复发性和肺转移骨肉瘤患者γδT细胞对骨肉瘤细胞的杀伤作用。本研究显示，使用GSK343后，U373细胞中STAT4蛋白磷酸化、IFN-γ蛋白表达水平显著升高，提示GSK343抑制脑胶质瘤细胞中EZH2蛋白表达后，可进一步促进STAT4磷酸化及IFN-γ蛋白表达，影响细胞增殖与凋亡。

近年来，γδT细胞在抗肿瘤免疫效应细胞中研究较多，体外扩增γδT细胞在肿瘤的临床治疗中疗效较好。但肿瘤细胞为γδT细胞识别的表面分子丢失易造成免疫逃逸，发生免疫耐受，为了提高γδT细胞的临床肿瘤治疗疗效，研究人员通过优化治疗方案，以期提高γδT细胞的杀伤活性。近年来研究显示，GSK343在癌症治疗方面具有良好疗效[14]，但其对肿瘤细胞中γδT细胞的杀伤作用的影响尚不完全明确。本研究结果显示，使用GSK343后，U373细胞更易发生形态变化，各个时间点的γδT细胞对U373细胞的杀伤活性均显著升高，提示GSK343有助于提高γδT细胞对U373细胞的杀伤活性，防止肿瘤免疫逃逸。赵珺等[15]研究显示，托法替尼可通过抑制抗原刺激后人γδT细胞的活化及STAT4磷酸化、IFN-γ产生，从而抑制γδT细胞功能，治疗自身免疫性疾病类风湿性关节炎。故推测GSK343可能通过调控EZH2，影响STAT4/IFN-γ通路，进而增强γδT细胞对U373细胞的杀伤作用，但具体作用机制还有待深入探究。

综上所述，GSK343可通过下调EZH2表达及上调STAT4蛋白磷酸化、IFN-γ蛋白表达从而提高γδT细胞对脑胶质瘤U373细胞的杀伤作用，导致U373细胞增殖受到抑制，并诱导其凋亡，其对γδT细胞杀伤作用的提高可能有助于提高临床免疫治疗疗效。但本研究为细胞体外培养实验，在体内的效果还需进一步验证，GSK343影响U373细胞EZH2/STAT4/IFN-γ通路与影响γδT细胞杀伤作用的内在联系还需深入研究。