miR-30a-5p靶向URGCP调控胃癌细胞凋亡和糖酵解的机制研究

杨 勐

(安徽省宿州市第一人民医院消化内科， 安徽 宿州 234000)

胃癌(Gastric cancer,GC)作为一种非常常见的恶性肿瘤，目前在全球癌症死亡中排名第二[1]。截止目前，手术作为GC的唯一治疗手段仍被广泛应用，但经根治性切除手术的GC患者有超过半数都会表现出局部复发或伴远处转移，已严重降低了患者的生存质量[2]。因此，有必要寻找新的GC治疗靶点，以便更好地了解GC发生的分子机制从而开发出高效的靶向治疗药物。MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性、非编码的单链小分子RNA，主要通过介导下游基因在转录后水平的表达来参与调控包括肿瘤在内的多种生物学过程[3]。越来越多的研究表明miRNAs在GC发生发展的多个阶段异常表达[4,5]。最近有研究报道[6]，miR-30a-5p可以在调控GC进展中作为肿瘤抑制因子存在，通过靶向下调YAP1的表达抑制GC细胞的增殖和侵袭。此外，细胞增殖调控基因4(Up-regulated gene 4/Up-regulator of cell proliferation,URG4/URGCP)作为促癌因子已被证实在包括GC在内的多种人类肿瘤中高表达[7]。本研究通过探讨miR-30a-5p和URGCP在GC细胞中的表达差异及两者对GC细胞凋亡和糖酵解的影响，旨在为GC的靶向治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂及耗材:人正常胃黏膜上皮细胞(GES-1)和GC细胞(AGS、HGC-27和SGC-7901)购买自上海生命科学研究院；RPMI-1640培养基、胰蛋白酶和胎牛血清购买自美国Gibco公司；TRIzol试剂和LipofectamineTM3000转染试剂购买自美国Invitrogen公司；CCK-8细胞活性检测试剂盒、ATP检测试剂盒、乳酸检测试剂盒和Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购买自上海碧云天生物科技有限公司；cDNA反转录试剂盒TaqMan Reverse Transcription kit和PCR荧光定量试剂盒SYBR®Premix Ex TaqTMII Kit购买自日本Takara公司；miR-30a-5p mimic及其阴性对照miR-NC和URGCP过表达质粒(pcDNA-URGCP)及其空载质粒(pcDNA-NC)合成自上海汉恒生物公司； PCR引物合成自上海生物工程有限公司合成；其他常见分子生物学相关试剂与耗材购买自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养及转染:正常胃黏膜上皮细胞(GES-1)和GC细胞(AGS、HGC-27和SGC-7901)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。培养箱孵育条件设置为37度C，5%CO2和95%的相对湿度。待细胞融合度达到90%以上时进行传代培养，取3代以后的对数期细胞用于后续实验。对数期GC细胞按2×104个/孔的密度接种于6孔板中，按实验要求将细胞分为Control组、miR-NC组、miR-30a-5p mimic组、pcDNA-NC组、pcDNA-URGCP组和pcDNA-URGCP+miR-30a-5p mimic组，除Control组外，采用LipofectamineTM3000转染试剂分别转染miR-NC、miR-30a-5p mimic、pcDNA-NC、pcDNA-URGCP和pcDNA-URGCP+miR-30a-5p mimic。转染24h后，RT-PCR用于检测转染效率。

1.2.2CCK-8实验检测细胞增殖:将转染后的各组HGC-27细胞按1×103个/孔的密度接种于96孔板中，分别孵育24h、48h、72h后再于每孔加入10μL的CCK-8试剂，继续培养4h。采用自动酶标仪检测各孔细胞在450nm波长处的吸光度值以反映各组细胞增殖能力。

1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡:将转染后的各组HGC-27细胞按3×105个/孔的密度接种于6孔板中常规培养过夜。细胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化后经高速低温离心，再悬浮在100μL的FITC结合缓冲液中。随后，在避光条件下，加入5μL Annexin V/FITC和5μL PI与细胞混匀，室温孵育30min。采用流式细胞仪检测细胞凋亡水平。

1.2.4ELISA试剂盒检测细胞ATP和乳酸水平:将转染后的各组HGC-27细胞按1×106个/孔的密度接种于6孔板中常规孵育24h。严格按照ELISA试剂盒操作方法，通过ATP检测试剂盒和乳酸检测试剂盒检测miR-30a-5p和URGCP对细胞内ATP和乳酸水平的影响。

1.2.5PCR检测细胞相关mRNA表达:采用TRIzol试剂从转染后的各组HGC-27细胞中提取总RNA。随后，使用cDNA逆转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。根据制造商的说明，使用SYBR®Premix Ex TaqTMII Kit试剂盒在ABI 7500H检测系统中实施PCR定量反应。PCR条件为：72℃预变性20min，95℃变性10min，60℃退火3min，共计45个循环。以GAPD或U6分别作为miR-30a-5p和URGCP的内参。数据采用2-ΔΔCq方法进行统计分析。PCR引物序列如下所示：miR-30a-5p引物序列，F:5′-TACGGATCCCCTTCATCTTACTTTTTTCCCCCAA-3′和R:5′-ATCGCTAGCGAAACTAGAAGCTCGGTGTGAATA-5′；URGCP引物序列，F:5′- GACCTTGCTGCCGACATTTAT-3′和R:5′-GCAGGAAACTGTCTGAGGAGAG-5′；GAPDH引物序列，F:5′-GCGGTGTCAAAGTGGAGAG-3′和R:5′-TGCTCGGTAGAAGGAGAAGATG-3′；U6引物序列，F:5′-AGTAAGCCCTTGCTGTCAGTG-3′和R:5′-CCTGGGTCTGATAATGCTGGG-5′。

1.2.6双荧光酶素报告检测miR-30a-5p和URGCP之间的靶向关系:设计合成URGCP的野生型(WT)和突变型(MUT)3'UTR，并将其克隆到psiCHECK-2荧光酶素表达载体中，以此得到URGCP-WT和URGCP-MUT荧光酶素报告载体。将miR-30a-5p mimic或miR-NC分别与URGCP-WT或URGCP-MUT通过LipofectamineTM3000试剂共转染293T细胞。双荧光素酶报告检测系统用于检测各组细胞的荧光素酶活性。

1.3统计学分析:数据以平均值±标准差表示。使用SPSS22.0软件对数据进行统计分析。采用t检验或单因素方差分析来评估两组或多组间的差异。P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1各组GC细胞中的miR-30a-5p和URGCP mRNA表达水平:相比较正常胃黏膜上皮细胞GES-1，GC细胞(AGS、HGC-27和SGC-7901)中的miR-30a-5p表达水平均明显下降(t=12.531,P<0.01;t=13.213,P<0.01;t=12.912,P<0.01)，见图1A。此外，URGCP在GC细胞(AGS、HGC-27和SGC-7901)中的表达水平明显高于GES-1组(t=11.124,P<0.01;t=10.214,P<0.01;t=12.141,P<0.01)。值得注意的是，miR-30a-5p在HGC-27细胞中的表达水平最高，而URGCP在HGC-27细胞中的表达水平最低，因此选择差异性表达最大的HGC-27细胞用于后续实验研究。见图1B。

图1 各组GC细胞中的miR-30a-5p和URGCPmRNA表达水平

2.2过表达miR-30a-5p对HGC-27细胞增殖和凋亡的影响:相比较miR-NC组，转染miR-30a-5p mimic的miR-30a-5p mimic组细胞中的miR-30a-5p表达明显升高(F=134.142,P<0.01)。这一步骤代表了miR-30a-5p过表达质粒转染成功，见图2A。接下来，通过CCK-8实验检测过表达miR-30a-5p对HGC-27细胞增殖能力的影响。相比较miR-NC组，miR-30a-5p mimic组细胞的增殖活性在72h时明显降低(F=213.213,P<0.01)，提示过表达miR-30a-5p能抑制HGC-27细胞增殖，见图2B。通过流式细胞仪检测过表达miR-30a-5p对HGC-27细胞凋亡能力的影响。相比较miR-NC组，miR-30a-5p mimic组细胞的凋亡水平明显升高(F=421.243,P<0.01)，提示过表达miR-30a-5p能促进HGC-27细胞凋亡，见图2C。

图2 过表达miR-30a-5p对HGC-27细胞增殖能力的影响

2.3过表达miR-30a-5p对HGC-27细胞糖酵解功能的影响:通过ELISA试剂盒检测过表达miR-30a-5p对HGC-27细胞中ATP和乳酸产生的影响。相比较miR-NC组，miR-30a-5p mimic组细胞的ATP水平明显降低(F=311.143,P<0.01)，同时乳酸水平也明显降低(F=324.142,P<0.01)，提示过表达miR-30a-5p能抑制HGC-27细胞中ATP和乳酸的产生，从而抑制HGC-27细胞的糖酵解功能，见图3。

图3 过表达miR-30a-5p对HGC-27细胞中ATP和乳酸产生的影响

2.4双荧光酶素报告实验检测miR-30a-5p和URGCP之间的靶向关系:通过Starbase生物信息网站(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)分析预测，miR-30a-5p与URGCP之间存在潜在的结合位点，见图4A。双荧光酶素报告实验结果显示，相比较miR-NC组，miR-30a-5p mimic组细胞中的URGCP-WT荧光酶素活性明显降低(t=15.143,P<0.01)，而对miR-30a-5p mimic组细胞中的URGCP-MUT荧光酶素活性无明显影响(t=1.873,P=0.172)，见图4B。随后，通过RT-PCR检测过表达miR-30a-5p对URGCP表达的影响。相比较miR-NC组，miR-30a-5p mimic组的URGCP表达明显降低(F=431.139,P<0.01)，见图4C。上述结果表明miR-30a-5p可以直接靶向集合URGCP并负调控URGCP在HGC-27细胞中的表达。

图4 双荧光酶素报告实验检测miR-30a-5p和URGCP之间的靶向关系

2.5共转染miR-30a-5p mimic和URGCP过表达质粒对HGC-27细胞增殖和凋亡的影响:相比较pcDNA-NC组，pcDNA-URGCP组URGCP明显升高(F=336.297,P<0.01)。相比较pcDNA-URGCP组，pcDNA-URGCP+miR-30a-5p mimic组URGCP明显降低(F=451.192,P<0.01)，见图5A。随后，通过CCK-8实验检测共转染miR-30a-5p mimic和pcDNA-URGCP对HGC-27细胞增殖能力的影响。相比较pcDNA组，pcDNA-URGCP组细胞增殖活性在72h时明显升高(F=298.123,P<0.01)。相比较pcDNA-URGCP组细胞，miR-30a-5p mimic+pcDNA-URGCP组细胞的增殖活性在72h时明显降低(F=314.342,P<0.01)，预示了过表达URGCP能缓解miR-30a-5p mimic对HGC-27细胞增殖活性的抑制作用，见图5B。通过流式细胞仪检测共转染miR-30a-5p mimic和pcDNA-URGCP对HGC-27细胞凋亡能力的影响。相比较pcDNA组，pcDNA-URGCP组细胞增凋亡水平明显降低(F=441.194,P<0.01)。相比较pcDNA-URGCP组细胞，miR-30a-5p mimic+pcDNA-URGCP组细胞的凋亡水平明显升高(F=493.192,P<0.01)，预示了过表达URGCP能缓解miR-30a-5p mimic对HGC-27细胞凋亡水平的促进作用，见图5C。

图5 共转染miR-30a-5p mimic和URGCP过表达质粒对HGC-27细胞增殖能力的影响

2.6共转染miR-30a-5p mimic和URGCP过表达质粒对HGC-27细胞糖酵解功能的影响:最后，通过ELISA试剂盒检测共转染miR-30a-5p mimic和pcDNA-URGCP对HGC-27细胞中ATP和乳酸产生影响。相比较pcDNA组，pcDNA-URGCP组细胞的ATP和乳酸水平明显升高(F=392.231,P<0.01；F=332.832,P<0.01)。相比较pcDNA-URGCP组细胞，miR-30a-5p mimic+pcDNA-URGCP组细胞的ATP和乳酸水平明显降低(F=413.141,P<0.01；F=392.194,P<0.01)，预示了过表达URGCP能缓解miR-30a-5p mimic对HGC-27细胞糖酵解功能的抑制作用，见图6。

图6 共转染miR-30a-5p mimic和URGCP过表达质粒对HGC-27细胞中ATP和乳酸产生的影响

3 讨 论

最近研究发现miR-30a-5p在GC中具有肿瘤抑制作用[6]。然而，miR-30a-5p调控GC发生发展的分子机制仍尚不清楚。本研究揭示了miR-30a-5p在GC中的表达模式及其对GC细胞生物学过程的调控。发现miR-30a-5p在GC细胞中的表达明显降低。此外，下调miR-30a-5p表达能有效抑制GC细胞增殖和糖酵解，并促进细胞凋亡。此外，还揭示了miR-30a-5p可以负靶向调控URGCP。过表达URGCP能缓解miR-30a-5pmimic对GC细胞生长的抑制作用。

MiR-30a-5p作为一种被广泛研究的非编码RNAs已被报道在多种肿瘤中发挥作用[8,9]。例如，沉默miR-30a-5p基因可以通过靶向Septin-7和PRDM1基因来抑制胶质瘤细胞生长[10]。结肠癌中，过表达miR-30a-5p可以通过靶向DLT抑制癌细胞的增殖。目前miR-350-5p在GC中的研究局限于miR-30a-5p在GC中可以作为抑癌因子存在，抑制细胞增殖、迁移和侵袭缓解GC细胞生长。本研究显示miR-30a-5p在GC细胞系中的表达明显降低，提示其下调可能参与GC的发生发展。随后，证实了miR-30a-5p过表达可以显著抑制HGC-27细胞的增殖并诱导细胞凋亡，提示miR-30a-5p对GC有明显的抑制作用。此外，研究首次证实了miR-30a-5p对GC细胞糖酵解功能的影响。研究表明大多数癌细胞即使在有氧气的情况下也会优先利用糖酵解，而不是线粒体氧化磷酸化来获取能量。这种能量代谢方式可以满足包括GC细胞在内各种肿瘤细胞的快速增殖和恶性进展加剧。本研究结果首次证实在HGC-27细胞中过表达miR-30a-5p在抑制细胞增殖并诱导凋亡的同时，能显著减少HGC-27细胞内ATP和乳酸的产生，这一结果表明了miR-30a-5p可以通过抑制GC细胞的糖代谢过程发挥抑癌作用。

由于miRNAs可以通过负调控其靶mRNA蛋白表达影响GC细胞的生长，本研究继续探讨了miR-30a-5p在GC中的可能靶点。生物信息学分析表明，URGCP是miR-30a-5p的潜在靶点。为了验证这一预测，进行了荧光素酶报告分析。结果表明，miR-30a-5p与URGCP mRNA的3'UTR直接结合，提示URGCP是miR-30a-5p的直接靶点。进一步观察后，HGC-27细胞中URGCP的表达是由miR-30a-5p在转录后水平负调控的。既往报道显示，URGCP是一种细胞增殖上调因子，在多种肿瘤的生长过程中发挥着促进作用。在GC中也有研究报道，miR-671-5p通过靶向URGCP抑制GC细胞增殖，促进细胞凋亡，对胃癌具有保护作用。然而，关于URGCP在GC中的上游调控机制仍需要进一步探索。在本研究中，URGCP表达的上调明显逆转了miR-30a-5p过表达对HGC-27细胞增殖及糖酵解的抑制作用和细胞凋亡的促进作用，表明URGCP在miR-30a-5p介导的抑制GC细胞生长中起下游效应。

本研究证明了miR-30a-5p作为一种在GC中显著下调的miR，可以通过直接靶向URGCP抑制GC细胞的增殖和糖酵解，并诱导细胞凋亡。这些结果进一步揭示了miR-30a-5p/URGCP轴在GC中的调控机制，提示了miR-30a-5p可以作为GC治疗的潜在靶点。