宏基因二代测序技术在支气管肺泡灌洗液病原检测中的临床应用

任小宏 代继宏

在儿童呼吸系统疾病中，顺位排名第一的疾病分类类目是肺部感染，是最常见的儿童死因之一[1-2]。据报道，我国每天至少有约1000名左右的5岁以下儿童因感染肺炎而死亡[3]，肺炎死亡原因中与病原体感染相关占有62%[4]，可见确诊儿童肺部感染的病原学显得尤为重要。长期以来，研究主要依靠传统病原菌培养，其方法时间长、阳性率低，对未知病原体无法检测[5]。宏基因二代测序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)可以无偏倚地检测出所有潜在病原体，指导用药，降低死亡率。故宏基因二代测序技术对重症或难治性的儿童肺部感染的诊断和治疗具有重要价值。本研究回顾性的分析了部分重症或难治性的儿童肺部感染患者的灌洗液宏基因二代测序检测的病原学结果，为mNGS的临床应用提供参考。

资料与方法

一、研究对象

收集2020年1月至2020年10月在重庆医科大学附属儿童医院住院治疗的46例重症或难治性肺部感染患者的临床资料，包括：年龄、性别、临床表现、行mNGS检测前的住院天数、行mNGS检测前使用丙球、行mNGS检测前使用抗生素、影像学改变、实验室检查、传统培养的病原学结果与支气管肺泡灌洗液mNGS检测的病原学结果等基本情况，并对其进行统计及分析，资料真实、可靠且准确。对于儿童社区获得性肺炎(CAP)的诊断标准将按照国家卫生健康委会同国家中医药管理局组织制定的2019年版儿童社区获得性肺炎诊疗规范[6]诊断。

二、方法

1 标本采集 支气管肺泡灌洗液标本：通过规范化培训的专业的支气管镜医师在全麻下行支气管镜检查及支气管肺泡灌洗术，通过吸收器吸引并获取支气管肺泡灌洗液[7]，回收的支气管肺泡灌洗液分为两管，分别行支气管肺泡灌洗液培养和支气管肺泡灌洗液mNGS检测，其样本量分别不低于3 mL和5 mL。痰液样本：如果建立了人工气道，则使用一次性痰液收集器获取痰液；如果没有建立人工气道，早晨收集痰液，在留痰前用少量水漱口至少3次，然后用力呼吸，咳出深部呼吸道的痰，并将其放入痰盒中，采集的痰液标本量不得少于1 mL；标本每次收集后均立即进行送检。

2 病原菌检测 支气管肺泡灌洗液mNGS检测：本实验的检测结果利用illumina公司的高通量测序技术对样品中的病原微生物进行全面检测和分析，并与数据库中的核酸序列进行比较，进一步确定样品中可疑的致病微生物。传统培养检测：采用法国生物梅里埃生产的VITEK 2 COMPACT检测仪进行病原体鉴定，并根据《全国临床检验操作规程》进行相关操作。

3 观察指标 观察患者的临床资料：性别、年龄、临床症状、行mNGS检测前的住院天数、行mNGS检测前使用丙球、行mNGS检测前使用抗生素、影像学改变、实验室检查[8]等。

三、统计学分析

采用SPSS 25.0统计软件进行统计分析，分类变量资料采用例数(构成比)表示，使用卡方检验进行比较分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、一般资料

回顾性分析2020年1月至2020年10月在重庆医科大学附属儿童医院住院治疗的46例重症或难治性的肺部感染患者的临床资料，其中男24例(52.2%)、女22例(47.8%)；年龄在2月～15岁之间，平均年龄为7.5岁。

二、支气管肺泡灌洗液mNGS检测与传统培养检测阳性率的比较(见表1)

表1 支气管肺泡灌洗液mNGS检测与传统培养检测阳性率的比较[n(%)]

通过表1，可见支气管肺泡灌洗液mNGS检测阳性率明显高于传统培养，差异有统计学意义(χ2=25.348，P<0.05)。

三、支气管肺泡灌洗液mNGS检测与传统培养检测的病原体分布(见表2)

表2 两种不同的检测方法的病原体分布

42例患者支气管肺泡灌洗液mNGS检测结果阳性，共检测到103株病原体，其中有检测到细菌、真菌、病毒、沙眼衣原体。17例患者传统培养检测结果阳性，共检测到24株病原体，均为细菌。分析发现支气管肺泡灌洗液mNGS检测对病毒、真菌、细菌、特殊的病原体检测阳性率高于传统培养(见图1)。

图1 支气管肺泡灌洗液mNGS检测与传统培养的病原体种类分布

四、支气管肺泡灌洗液mNGS检测与传统培养在病原体检测上的一致性比较(见表3)

表3 支气管肺泡灌洗液mNGS检测与传统培养病原学检测一致性比较

支气管肺泡灌洗液mNGS检测与传统培养检测均阳性患者15例，其中2例检测的病原体一致，13例检测的病原体不一致；27例支气管肺泡灌洗液mNGS检测阳性，但传统培养结果阴性；3例支气管肺泡灌洗液mNGS与传统培养结果均阴性，可见其一致性差。

五、不同特征患者支气管肺泡灌洗液mNGS阳性检出率的比较

搜集46例行支气管肺泡灌洗液mNGS检测患者的临床资料，包括患者性别、年龄、临床症状、行mNGS检测前的住院天数、行mNGS前使用丙球、行mNGS前使用抗生素、影像学提示肺炎、实验室检查等，比较不同特征患者支气管肺泡灌洗液mNGS阳性检出率。

通过表4，发现行支气管肺泡灌洗液mNGS检测前影像学提示肺炎、PCT有统计学意义(P<0.05)；其余指标组间差异均没有统计学意义(P>0.05)。

表4 不同特征患者支气管肺泡灌洗液mNGS阳性检出率的比较 [n(%)]

讨 论

随着现代科学的不断发展，在儿童疾病谱中呼吸系统疾病一直位于首位，肺炎成为呼吸系统疾病最多见的[1-2]，而因病原体直接感染而导致儿童死亡的肺炎占62%[4]，儿童肺部感染性疾病对儿童的身体健康影响巨大，这就需要更先进的诊疗技术帮助诊断与治疗，对于儿童感染性肺部疾病来讲，最主要的问题是如何找到病原学，从而对临床用药提供帮助，进一步提高治疗效果，减少死亡率，而既往的检查有其局限性，mNGS以其高通量、快速检测和其高敏感性等优势，进一步在感染性疾病中，起到了重要的作用。

研究结果显示支气管肺泡灌洗液mNGS检测和传统培养检测的阳性率分别为91.3%、36.9%，可见支气管肺泡灌洗液mNGS检测阳性率远远高于传统培养，与既往文献报道具有一致性[9-11]，进一步说明采用支气管肺泡灌洗液mNGS检测可以提高病原体的检出率。

本研究中，42例患者支气管肺泡灌洗液mNGS检测结果阳性，病原体种类分别为：细菌56株、真菌14株、病毒32株、沙眼衣原体1株；17例患者传统培养检测结果阳性，其中共检测到病原体24株，均为细菌；可见对病毒、真菌、细菌、特殊的病原体的检测中支气管肺泡灌洗液mNGS检测的阳性率远远高于传统培养，与既往支气管肺泡灌洗液mNGS检测应用于病毒、真菌、细菌、特殊的病原体等方面的相关报道一致[9-12]。

本研究中，支气管肺泡灌洗液mNGS与传统培养在病原体检测结果的一致性比较中，2例检测到的病原体一致，主要为肺炎链球菌、流感嗜血杆菌；13例检测到的病原体不一致，在检测结果不一致的例数中通过不同的检测方法检测到的病原学分布情况(见表5)，可见：在肺炎链球菌的检出中痰培养比支气管肺泡灌洗液培养检出率高，而对卡他莫拉菌的检出中痰培养比支气管肺泡灌洗液培养及支气管肺泡灌洗液mNGS检测的检出率高，在流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌的检出中支气管肺泡灌洗液mNGS检测比传统培养检出率高，在金黄色葡萄球菌的检出中支气管肺泡灌洗液mNGS检测和灌洗液培养比痰培养检出率高，支气管肺泡灌洗液mNGS检测比传统培养检测到的病原体种类多，同时传统培养可能培养出不确定具体病原体而只能确定种类的情况，足以显示其局限性。27例传统培养检测阴性但支气管肺泡灌洗液mNGS检测阳性，可见在传统培养无法检测到的病原体中，支气管肺泡灌洗液mNGS检测具有较高的临床价值。另外有1例传统培养检测阳性而支气管肺泡灌洗液mNGS检测阴性，有3例支气管肺泡灌洗液mNGS及传统培养结果均为阴性，分析灌洗液mNGS检测阴性可能的原因：(1)标本确实无相应病原体感染；(2)由于标本为支气管肺泡灌洗液，故支气管镜操作者的技术可能会对检测结果有所影响，需要提高支气管镜操作者的技术水平；(3)检测仪器本身对一些特殊的病原体无敏感性或检出率很低，故需进一步改进仪器；(4)由于我院的支气管肺泡灌洗液mNGS检测最终都是送到院外检测机构，这就延长了送检时间，对支气管肺泡灌洗液mNGS的检测结果有影响。

表5 检测结果不一致的例数通过不同的方法检测到的病原学分布

本研究中，通过对临床资料的分析，比较不同特征患者支气管肺泡灌洗液mNGS阳性检出率，发现性别、年龄、临床症状、行mNGS检测前住院天数、行mNGS检测前使用丙球、行mNGS检测前使用抗生素、实验室检查等均无统计学意义，而仅影像学提示肺炎、PCT有统计学意义，其中影像学提示肺炎比影像学提示无肺炎的检出率更高(95.2%对50.0%)，可进一步表明支气管肺泡灌洗液mNGS检测对重症或难治性儿童肺部感染病原学检出有较高的临床应用价值。但由于本研究的样本量较少，仍需要较大的样本量进一步研究验证，且本研究的PCT的特征中大部分为PCT≤0.5，故可进一步研究PCT与支气管肺泡灌洗液mNGS阳性检出率的关系及影响。

结 论

综上所述，在支气管肺泡灌洗液中使用mNGS检测可以提高重症或难治性的儿童肺部感染病原体的检出率，尤其是在真菌、病毒和特殊的病原体方面。在传统培养不能检测到病原体的患者中，支气管肺泡灌洗液mNGS可作为一种有效的检测方法，指导临床药物的应用，提高治疗效果，减少死亡率。所以，支气管肺泡灌洗液mNGS检测在我国重症或难治性的儿童肺部感染的临床诊断和治疗中具有较高的临床应用价值。