山东省酱油微生物污染检测及鉴定

张佳惠*，王芳，郭树静，邓宁

1. 德州市食品药品检验检测中心（德州 253000）；2. 山东省产品质量检验研究院（济南 250000）

酱油是以大豆和/或脱脂大豆、小麦和/或小麦粉和/或麦麸为主要原料，经微生物发酵制成的具有特殊色、香、味的液体调味品[1]。酱油口感鲜美，我国周朝时期就生产酱油，历史悠久，是酱油的发源地。随着人们整体生活水平的日益提升，我国酱油产销量逐年增加，2020年中国酱油产量达700.8万 t，需求量达686.2万 t，人均需求量每年达4.76 kg/人[2]。

酱油作为日常生活必需品，对人民的身体健康至关重要。近几年，国内对酱油生产工艺中微生物的功能及变质胀袋酱油中微生物的分离鉴定研究较多[3-6]，但对预包装酱油微生物污染状况文献报道较少，缺乏酱油检测中菌落总数检出率的报道，缺乏对未变质酱油中存活的微生物的分离、鉴定，不了解该类微生物的潜在危害，使人民的饮食健康存在隐患。2017—2021年，结合《国家食品安全监督抽检实施细则》和GB 2717—2003/2018《食品安全国家标准 酱油》，在山东省内抽检600多份预包装酱油检测微生物。该试验总结分析600多份预包装酱油样品菌落总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的检测结果，结果发现有些酱油菌落总数较高，但酱油样品均无变质现象，致使消费者不易辨别酱油质量的好坏。该试验对检出率较高的微生物进行鉴定，了解其来源、危害，为食品监管部门提供技术支撑，为食品企业安全生产提供指导依据，为人民饮食安全提供重要保障。

1 材料与方法

1.1 材料

2017—2021年国家市场监督管理局、山东省市场监督管理局、德州市市场监督管理局各季度监督抽检和专项行动检查检测的600多份预包装酱油的检测报告。样品覆盖78家生产企业，其中74家山东生产企业，3家广东生产企业，1家河南生产企业。进行分离、纯化、鉴定试验的为2021年预包装酱油样品。

1.2 培养基、试剂

平板计数琼脂（PCA）培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）培养基、Baird-Parker培养基基础、缓冲蛋白胨水（BPW）、血琼脂平板、革兰氏染色液试剂盒，北京路桥技术股份有限公司；氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；VITEK2革兰氏阴性/阳性细菌鉴定卡片，生物梅里埃美国股份有限公司。

1.3 主要仪器与设备

梅里埃VITEK2 compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统，生物梅里埃公司；生物安全柜，西班牙泰事达公司；显微镜，日本奥林巴斯株式会社；高压灭菌器，松下健康医疗器械株式会社；超净工作台，上海力康；生化培养箱，天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司。

1.4 方法

1.4.1 检测方法

菌落总数检测按照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》；大肠菌群检测，样品生产日期在2019年12月21日之后的按照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》平板计数法，生产日期在2019年12月21日之前的按照GB 4789.3—2003《食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定》；金黄色葡萄球菌检测按照GB 4789.10—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》；沙门氏菌检测按照GB 4789.4—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验沙门氏菌检验》。

1.4.2 判定方法

样品生产日期在2019年12月21日之后的按照GB 2717—2018《食品安全国家标准 酱油》判定，生产日期在2019年12月21日之前的按照GB 2717—2003《食品安全国家标准 酱油》判定。

1.4.3 分离、纯化、鉴定方法

选择菌落个数适宜的PCA平板，挑取平板上的单个菌落，划线分离培养于血琼脂平板纯培养，于36±1 ℃培养18～24 h。挑取血琼脂平板的单个菌落，革兰氏染色镜检，VITEK2 compact全自动微生物分析系统鉴定定性。

2 结果与分析

2.1 酱油中菌落总数

菌落总数是指示性微生物指标，用来评价食品被细菌污染的程度，反映食品在生产过程中的卫生状况。如果食品的菌落总数严重超标，将会破坏食品的营养成分，使食品失去食用价值；还会加速食品腐败变质，可能危害人体健康[7]。结果显示，共164份样品检测菌落总数，其中不合格4份，合格率为97.6%。虽然合格率较高，但由表1可以看出，检测结果＜1（未检出）的样品数仅占10.4%，有菌落生长的样品数占比较大，检出率占89.6%。全部样品包括不合格样品感官试验合格，具有应有的色泽、滋味和气味，无异味，不浑浊，无正常视力可见外来异物，无霉花浮膜，无胀瓶现象。这就使得消费者不易辨别酱油质量的好坏，日常饮食中易误食此类菌落总数不合格或较多的酱油，且随使用时间的增长，菌落总数逐渐增加，对身体健康存在极大的危害。

表1 酱油中菌落总数检测结果

2.2 酱油中大肠菌群

大肠菌群是食品被粪便污染情况的指示性微生物，反映食品被肠道致病菌污染的程度[8]。结果显示，共210份样品检测大肠菌群，全部合格，合格率为100%，而且检测结果均＜1（GB 4789.3—2016）或＜30（GB 4789.3—2003），检出率为0。此次检测结果与周家达[9]、张凤英等[10]的研究结果一致，大肠菌的耐盐能力不强，预包装酱油成品基本都接近食盐饱和的浓度，故市售预包装酱油中大肠菌基本不能生存，检测不出大肠菌群，建议继续调查研究，完善酱油国家标准对大肠菌群的检测规定。

2.3 酱油中致病菌

食源性致病菌是食物中毒和食源性疾病暴发的重要因素，是食品安全的主要风险隐患[11]。结果显示，共460份样品检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌，全部合格，合格率为100%。而且金黄色葡萄球菌检测结果均＜1（未检出），沙门氏菌均未检出。460份样品均合格，表明我省酱油生产、运输、销售过程中致病菌污染程度低。

2.4 酱油中杂菌的分离、纯化、鉴定

为鉴定广泛存在但暂未引起酱油变质的微生物，探究其对人体的潜在危害，观察有菌落生长的PCA平板，选取出现频率较高的两株菌落进行分离、纯化、鉴定。

一种菌落在血琼脂平板菌落形态呈灰色、光滑、湿润、凸起；染色镜检为革兰氏阴性杆菌，经VITEK2 compact全自动微生物分析系统鉴定为少动鞘氨醇杆单胞菌。食品中报道少动鞘氨醇单胞菌的文献极少，其在药品、临床医疗中报道较多，是一种条件致病菌，在水路管道和环境中广泛存在，对营养条件要求极低，在贫营养甚至消毒环境也能长期存在[12-13]。因而建议监管部门和生产企业严格对生产设备、管路、车间的检查，对其定期有效消毒，以降低酱油成品中的菌落总数。

另一种菌落在血琼脂平板上菌落形态呈灰白色、光滑、湿润、凸起；染色镜检为革兰氏阴性杆菌，经VITEK2 compact全自动微生物分析系统鉴定为放射根瘤菌。放射根瘤菌在土壤中广泛存在，食品中尚未见报道检出，Wang等[14]、陈学兵等[15]报道临床检验中检出放射根瘤菌，其是一种条件致病菌，当人体免疫功能低下或某部位有创伤时可能造成感染，引起败血症、心内膜炎、尿路感染或腹膜炎等。根据其特性，推测该菌落来源于生产原料，建议生产企业加强对酱油原料的清洗，优化生产灭菌工艺，以降低酱油成品中的菌落总数，提高产品质量。

3 结论与讨论

该试验对在山东抽检的600多份预包装酱油样品进行了微生物指标检测，其中164份检测菌落总数，210份检测大肠菌群，460份样品检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌。大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌均合格，未检出菌落；菌落总数4批不合格，但147份样品有菌落生长。经鉴定，检出率较高的微生物为环境中常见的条件致病菌少动鞘氨醇单胞菌、放射根瘤菌，对人民的健康存在潜在危害，但对两种菌的具体来源、最佳灭菌工艺还未试验追踪，需今后进一步实验探讨。因此，建议监管部门和生产企业加强对生产环境、原料的监控，提升酱油成品的品质，保障人民群众的饮食安全。