木枣汁发酵中酶、代谢产物以及味觉的变化

张玲，韩基明，张江宁，丁卫英，杨春*

山西农业大学，山西功能食品研究院（太原 030031）

红枣为鼠李科（Rhamnaceae）枣属（Ziziphus MIll）植物的果实，含有丰富的营养成分，也是常用的中药材[1]。现代研究表明，红枣中的多糖、三萜类物质、环磷腺苷和黄酮苷等都是很强的抗氧化剂，其有清除自由基的功能，对提高机体免疫力和抗氧化作用的效果显著[2-5]。我国枣的品种繁多，不同品种的枣中各营养和活性成分含量有一定的差异[6]。木枣主要分布在山西省吕梁地区和陕西省榆林地区黄河沿岸，为当地主栽品种，也是全国仅次于金丝小枣栽培面积的品种[7]，且木枣中的营养物质和生物活性成分含量较高[8-9]。研究以山西临县木枣为原料，同时利用益生菌的作用对枣汁进行发酵，并进一步分析发酵过程中主要功效酶活性、相关代谢产物以及味觉的变化规律，可为红枣发酵功能制品的开发提供一定的理论基础和技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

木枣（山西临县）；果蔬酵素益生菌发酵剂（安琪）；果胶酶（北京索莱宝）；纤维素酶（北京索莱宝）；芦丁（北京索莱宝）；没食子酸（北京索莱宝）；葡萄糖（北京索莱宝）；乳酸试剂盒（北京索莱宝）；SOD酶试剂盒（南京建成）；多酚氧化酶试剂盒（南京建成）；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

WAY-2S蔗糖仪（上海卓光仪器科技有限公司）；Multiskan Go酶标仪（Thermo Scientific）；SC-3610离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；SPX-100B-Z培养箱（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 木枣汁的发酵

称取400 g鲜木枣，加入1 200 mL水，打浆后加入0.4 g果胶酶、0.1 g纤维素酶后置于60 ℃水浴锅中酶解1 h，按3 500 r/min离心10 min，取上清液，备用。将制备好的木枣汁高温瞬时灭菌，冷却后按1∶2 000 g/mL枣汁的比例加入益生菌，置培养箱发酵，每隔1 d取样测试，连续7 d。

1.3.2 总糖的测定

参考文献[10]，采用DNS法，略有改动。发酵枣汁稀释10倍，取100 μL的样品稀释液，按照葡萄糖标准曲线制作方法测定其吸光度，并计算样品中还原糖的含量。

1.3.3 黄酮的测定

参考文献[11]。发酵枣汁稀释10倍，取1 mL的样品稀释液，按照芦丁标准曲线制作方法测定其吸光度，并计算样品中黄酮的含量。

1.3.4 总酚的测定

标准曲线的绘制：精确称取5 mg没食子酸标准样品，用蒸馏水定容至50 mL，分别准确量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL标准液于10 mL比色管中，分别加入6 mL蒸馏水，摇匀后加0.5 mL Folin酚试剂摇匀，1 min后加入1.5 mL 20%的碳酸钠溶液，混匀定容。75℃下恒温水浴反应10 min，取出冷却后在760 nm波长下测定吸光度，作标准曲线。

样品的测定：发酵枣汁稀释10倍，量取100 μL的样品稀释液，按照没食子酸标准曲线制作方法测定其吸光度，并计算样品中总酚的含量。

1.3.5 乳酸的测定

按照试剂盒说明书测定，原理：乳酸是生物体代谢过程中重要的中间产物，乳酸含量是评估糖原代谢和有氧代谢的重要指标。乳酸在乳酸脱氢酶的作用下生成丙酮酸，同时使NAD+还原生成NADH和H+，H+传递给PMS生成的PMSH2还原MTT生成紫色物质，在570 nm处有特征吸收峰。

1.3.6 超氧化物歧化酶（SOD）酶活的测定

根据超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒说明书进行操作。

SOD活性（U/mL）=[抑制百分率/（1-抑制百分率）×V反总]/V样×F（1）式中：V反总为反应液总体积，mL；V样为样液体积，mL；F为稀释倍数。

1.3.7 多酚氧化酶（PPO）的测定

根据多酚氧化酶（PPO）活性检测试剂盒说明书进行操作。果汁PPO活性单位定义：每分钟每毫升果汁在酶反应体系中使在420 nm处吸光度变化0.01为一个酶活力单位。

式中：ΔA为测定管吸光度与对照管吸光度之差。

1.3.8 味觉分析

将红枣发酵汁倒入电子舌专用烧杯至刻度线。按照设置的序列放置在电子舌自动进样器上。试验采用蒸馏水清洗和枣汁样本交替检测序列进行检测。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中总糖含量的变化

由图1可知，发酵第2天，木枣汁中糖含量增加，可能是因为微生物前期对枣汁中的多糖进行分解，导致枣汁中可溶性多糖溶于发酵的枣汁中，从而使发酵枣汁中总糖含量上升。发酵第3天总糖含量下降，之后趋于平稳，这是由于乳酸菌大量繁殖将枣汁中的糖代谢成乳酸等物质的结果。

图1 不同发酵时间枣汁中总糖含量变化

2.2 发酵过程中乳酸含量的变化

由图2可知，发酵前2 d，木枣汁中乳酸含量缓慢上升，到第3天枣汁中乳酸含量显著上升，这是由于乳酸菌开始大量繁殖将枣汁中的糖代谢成乳酸，之后乳酸含量又显著降低，这是由于随着发酵的进行，酸度和糖等条件发生改变，不利于乳酸菌的生长和产酸，并且在乳酸菌合成乳酸的同时，乳酸同样作为碳源被微生物利用，进而造成乳酸含量逐步降低。

图2 不同发酵时间枣汁中乳酸含量变化

2.3 发酵过程中总黄酮含量的变化

由图3可知，木枣汁发酵过程中总黄酮含量呈下降趋势，其原因可能是乳酸菌可分泌糖苷酶[12]：一方面将不溶性膳食纤维结合的黄酮释放形成水溶性黄酮；另一方面又可能将水溶性黄酮苷水解成不溶性黄酮苷元。在发酵后期，发酵产酸导致强酸环境，黄酮在强酸环境中不稳定也会被分解[13]。

图3 不同发酵时间枣汁中黄酮含量变化

2.4 发酵过程中总酚含量的变化

由图4可知，木枣汁发酵前2 d，总酚含量呈下降趋势，可能是因为枣汁中酚类物质被多酚氧化酶氧化成了醌类物质[14]，随着乳酸菌的大量繁殖，乳酸菌产生糖苷酶和酚酸酯酶[15]，将不溶性膳食纤维结合的酚类物质释放为可溶的游离态酚[16-17]，此外，枣汁pH发生下降，低酸环境也有利于保护酚羟基不发生氧化，因此发酵中期总酚含量呈上升趋势。随着发酵的继续进行，总酚含量下降，可能是因为枣汁中环境改变，酚类物质被氧化分解。

图4 不同发酵时间枣汁中总酚含量变化

2.5 发酵过程中SOD酶的变化

由图5可知，发酵前2 d，SOD酶活呈上升趋势，随着发酵的进行，SOD酶活逐渐下降，可能是因为随着乳酸菌发酵的进行，枣汁体系中成分和pH的改变，使得SOD酶活性下降。

图5 不同发酵时间枣汁中SOD酶含量变化

2.6 发酵过程中多酚氧化酶活性变化

由图6可知，随着发酵的进行，多酚氧化酶的酶活逐渐升高，第4天达到最高，之后随着发酵时间的延长，其酶活又逐渐下降，可能是因为发酵枣汁体系中成分和pH的改变，使得酶活性下降。

图6 不同发酵时间枣汁中多酚氧化酶酶含量变化

2.7 发酵枣汁的电子舌主成分分析

图7为不同发酵时间的枣汁主成分PCA分析图。第一主成分和第二主成分的总贡献率达到了97.2%，识别指数是90，足以收集特征信息。发酵3 d和发酵4 d的枣汁分布区域较近，其他发酵时间的枣汁分别聚类在PCA图中的不同区域，相互之间能够较好地被区分。

图7 发酵枣汁主成分分析

2.8 发酵枣汁的相似性分析

表1是7个不同发酵天数木枣汁电子舌相似性分析结果。发酵3 d和4 d的木枣汁两者之间的距离值最小，可知两者味觉的相似性较大。其次为发酵5 d和发酵6 d的枣汁，它们之间的距离为69.88，两者之间的味觉相似性也较大。发酵1 d和发酵7 d的木枣汁之间的距离值最大，可知两者的相似性最小。

表1 不同发酵天数的枣汁相似性分析

2.9 发酵枣汁的味觉分析

从表2可得知7个不同发酵天数木枣汁的酸、甜、苦、咸、鲜味的相对值。发酵3 d的木枣汁的酸味值较大，且苦味值较小。随着发酵时间的延长，枣汁的苦味值逐渐增加，发酵7 d时，其木枣汁的苦味值最大。

表2 不同发酵天数的枣汁味觉分析

3 结论

研究表明，枣汁益生菌发酵过程中，发酵前2 d因为乳酸菌对枣汁中的多糖进行分解，木枣汁中糖含量增加，随着发酵的进行，乳酸菌利用糖大量繁殖，使总糖含量下降，且乳酸含量逐渐增加，第3天达到最高。随着发酵时间的延长，枣汁中黄酮含量呈下降趋势，总酚发酵第2天含量下降，之后又呈上升趋势，发酵4 d后总酚含量又逐渐下降。枣汁发酵前2 d SOD酶活呈上升趋势，之后SOD酶活逐渐下降。发酵枣汁中多酚氧化酶的酶活逐渐升高，第4天达到最高，之后随着发酵时间的延长，其酶活又逐渐下降。同时，试验利用电子舌对不同发酵时间的木枣汁进行了味觉分析，综合其乳酸含量以及酸、甜、苦、鲜、咸味觉变化，其木枣汁益生菌发酵适宜的时间为3 d。