阿戈美拉汀自微乳给药系统的制备和体外质量评价

黄燕飞，张强，张雪，程泽能，3*（1.徐州医科大学药学院，江苏 徐州 221000；2.湖南慧泽生物医药科技有限公司，长沙 410000；3.中南大学湘雅药学院，长沙 410000）

近年来，抑郁症的患病率大幅增加[1]，阿戈美拉汀通过激活褪黑素受体（melatonin receptor，MT1和MT2）以及拮抗5-羟色胺受体（5-HT2c），在发挥抗抑郁疗效的同时兼具调节生物节律的作用，且不良反应小，现已成为抗抑郁的一线用药[2]。但阿戈美拉汀是生物药剂学分类（biopharmaceutics classification system，BCS）Ⅱ类药物（低溶解、高渗透），其首过效应大，口服绝对生物利用度低于5%，增大剂量会增加肝损伤的风险[3]。因此，急需找寻一种能提高阿戈美拉汀生物利用度、降低首过作用的制剂，从而可以通过降低给药剂量，达到减轻肝损伤的目的。

自微乳给药系统（self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS）是由油相、乳化剂（表面活性剂）和助乳化剂（助表面活性剂）组成的不含水的固体或液体制剂，口服后遇体液自发形成100 nm以下的O/W型微乳。SMEDDS不仅可以增加水难溶性药物的溶解度，而且可以通过增加药物淋巴途径的吸收[4-6]，降低首过效应。目前市场上已有的自微乳产品包括诺华制药的环孢素A（Neoral），艾伯维公司的利托那韦（Norvir），瑞典罗氏的沙奎那韦（Fortovase），葛兰素史克的安瑞那韦（Agenerase）等[7]，这些均表明自微乳具有良好的市场空间。目前暂未有将阿戈美拉汀制成自微乳的相关文献，且与已发表的将阿戈美拉汀超声乳化制成的纳米乳相比[8]，自微乳无需借助超声等外力作用，更有利于工业放大生产，且自微乳中不存在水，可以存储更长时间。本研究以星点设计-效应面法优化自微乳[9-10]，期望获得受外界环境影响较小，体外溶出快且粒径稳定的阿戈美拉汀自微乳，为工业化开发提供参考。

1 材料

1.1 仪器

BSA224S-CN型电子分析天平（德国赛多利斯）；Agilent 1200高效液相色谱仪，包括四元泵，VWD型紫外检测器（安捷伦）；FE28型pH计（瑞士梅特勒）；FADT-800RC型自动溶出仪（上海富科思）；THZ-92A型气浴恒温振荡器（上海博迅医疗生物仪器）；DHG-9140A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器）；LS-4000UVL型光照稳定性试验箱（北京天星科仪）；SHH-500SD-2T型药品稳定性试验箱（重庆永生）；纳米粒度电位仪（英国马尔文）；透射电子显微镜（日本日立）。

1.2 试药

阿戈美拉汀（原料药，北京海步医药，批号：1712004，纯度：99%）；阿戈美拉汀自微乳胶囊（自制样品）；0号胶囊（苏州胶囊）；单油酸甘油酯（Peceol）、中链甘油三酯（Labrafac lipophile WL1349）、油酰聚氧乙烯甘油酯（Labrafil M1944CS，简称1944cs）、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（Labrasol）、二乙二醇单乙醚（Transcutol HP）均为法国Gattefosse赠送产品；辛酸癸酸单双甘油酯（Capmul MCM）（美国Abitec）、聚氧乙烯氢化40蓖麻油（RH40）（德国BASF）；Tween 80（山东瑞生药用辅料）；PEG400（江西益普生药业）；丙二醇（湖北葛店人福）；乙醇、甲醇、乙腈（HPLC级，美国ACS）；磷酸二氢钾、磷酸（AR级，国药集团）。

2 方法与结果

2.1 HPLC-UV含量测定色谱条件

色谱柱：中谱红AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相 A∶B（35∶65）（流动相A：2.27 g磷酸二氢钾于1.0 L水中，磷酸调pH至2.5；流动相B：甲醇）；检测波长 230 nm；流速 1.0 mL·min-1；柱温 50℃；进样量 10 μL。

2.2 溶解度筛选

测定阿戈美拉汀在不同油相、表面活性剂、助乳化剂中的溶解度。试验方法：称取 1 g辅料，置于刻度离心管中，投入过量药物，涡旋使药物充分分散，水浴超声30 min，空气浴摇床（25℃，100 r·min-1）平衡 48 h，确保有药物沉淀。4000 r·min-1离心15 min，取上清液测定含量，计算溶解度，结果见表1。

表1 药物在不同辅料中的溶解度(25℃，100 r·min-1) Tab 1 Solubility of agomelatine in different adjuncts (25℃，100 r·min-1)

2.3 相容性试验

根据阿戈美拉汀溶解度结果，选择溶解度较大的辅料，油相（Capmul MCM、Peceol），表面活性剂（Labrasol、RH40、Tween 80），助表面活性剂（Transcutol HP）进行处方相容性考察。将油相和表面活性剂按质量比1∶1、1∶2、1∶3充分混合，取100 μL加入至10 mL的37℃纯化水中，在100 r·min-1的空气浴摇床上进行震荡使其发生乳化，在550 nm下测定其吸光度（A），计算透光率（T）（A＝-lgT，即T＝10-A×100%）[9]。当T＞90%，优选相应油相和表面活性剂。

以成乳后的色泽和乳化时间为考察指标，记录乳化情况[11]：Ⅰ.迅速分散乳化（≤1 min），形成澄清或微微泛蓝的微乳；Ⅱ.迅速分散乳化（≤2 min），形成蓝白色微乳；Ⅲ.分散乳化稍慢（≤3 min），形成亮白色奶状乳剂；Ⅳ.分散乳化慢（＞3 min），呈暗灰白色，外观略带油状；Ⅴ.分散乳化困难，无法形成均一体系。

由表2可知，油相Capmul MCM相较Peceol更容易被乳化，表面活性剂Labrasol、RH40乳化Capmul MCM的时间均在1 min以内；但Labrasol无论与哪种油相何种比例（1∶1、1∶2、1∶3），体系均呈乳白色，因此Capmul MCM∶Labrasol评价为Ⅱ，而RH40乳化的体系澄清，因此：Capmul MCM∶RH40＝1∶2、1∶3评价为Ⅰ；Tween 80为表面活性剂时，时间则需要3 min以上，且出现结块未完全乳化等问题。因此，表面活性剂确定为RH40。

在试验中发现，当油相为Peceol时，乳化均较困难，而当Peceol∶1944cs＝1∶1作为混合油相时，比单纯用Peceol更易被乳化。因此在试验中进一步补充了Peceol∶1944cs＝1∶1与表面活性剂Labrasol、RH40、Tween 80的相溶性考察的相关数据（见表2），表2中T＞90%有两个处方，即当Capmul MCM为油相时，Capmul MCM∶RH40＝1∶3，T为98.213%；当Peceol∶1944cs＝1∶1作为油相时，（Peceol∶1944cs＝1∶1）∶RH40＝1∶3，T为97.098%。这两个处方体系均呈澄清微微泛蓝光，满足要求。

综上，选用Capmul MCM、RH40、Transcutol HP作为处方1，Peceol、1944cs、RH40、Transcutol HP作为处方2，做进一步考察。

2.4 三元相图绘制

将表面活性剂RH40与助表面活性剂Transcutol HP先按质量比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9充分混匀组成混合表面活性剂，再将处方1、2中油相与混合表面活性剂按质量比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5进行复配。分别移取100 μL，缓慢加入10 mL纯化水中（37℃空气浴，100 r·min-1），取乳化后的溶液，采用纳米粒度仪测定乳滴的粒径及多分散指数（PDI）。

分别以油相、表面活性剂、助表面活性剂为三元相图三角形的三个顶点，在不含药（空白乳）和含药（载药乳）的基础上（药物的存在有时会影响三元相图的结果[12]），用Origin 2019b软件绘制三元相图。纳入标准为：乳化时间＜2 min，色泽澄清或者泛蓝光，粒径＜100 nm。满足上述要求的，在三元相图上记录相应的点，结果见图1。

图1 处方1和2的空白乳和载药乳的三元相图Fig 1 Ternary phase diagrams of the blank and drug-loaded SMEDDS for formulae 1 and 2

由图1结果显示，发现溶解度较大（处方1）的作为处方其形成三元相图的面积反而小于溶解度较低（处方2）的三元相图面积，且阿戈美拉汀的添加一定程度上会影响三元相图的分布范围，综 上，由Peceol、1944cs、RH40、Transcutol HP组成的空白乳和载药乳微乳区域面积均较大，因此选用处方2进行下一步优化。

2.5 星点设计-效应面优化法优化Agm-SMEDDS处方

在三元相图所得结果的基础上，以影响阿戈美拉汀自微乳性质最大的[即油相的质量占比Woil（X1）和表面活性剂与助表面活性剂质量之比Km（X2）]作为考察因素，X1的范围为三元相图得出的初步范围，即10%～40%，X2的范围为0.25～9，采用Design Expert 12.0软件，以两因素五水平进行星点设计，以微乳的平均粒径（Y1）、PDI（Y2）和载药量（Y3）为评价指标，因素和水平见表3。

表3 星点设计的因素和水平 Tab 3 Factor and level of the central composite design

按处方比例精密称取油相、表面活性剂、助乳化剂，投入过量药物，涡旋使药物充分分散，水浴超声30 min，空气浴摇床（25℃，100 r·min-1）平衡48 h，确保有药物沉淀，10 000 r·min-1离心10 min，取上清液即得阿戈美拉汀自微乳（Agm-SMEDDS）预浓缩液。精密称取预浓缩液0.1 g于10 mL量瓶，加入37℃的纯化水定容至刻度摇匀，10 000 r·min-1高速离心10 min，上清液用0.22 μm滤膜滤过[13]，量取续滤液1 mL，加入9 mL稀释剂（乙醇∶乙腈＝1∶4）稀释并混匀，按“2.1”项下方法测定Agm-SMEDDS 的载药量，结果见表4。

根据市售的阿戈美拉汀片剂为25 mg/片以 及溶解度结果，将25 mg/525 mg作为Agm-SMEDDS的规格，精密称取阿戈美拉汀原料药，按处方比例称取相应辅料，超声溶解药物，移取100 μL，用水稀释100倍，其平均粒径和PDI结果见表4。

表4 星点设计的试验和结果 Tab 4 Design and results of central composite design

在Design Expert 12.0软件中输入相应结果，根据软件推荐对平均粒径、PDI、载药量进行线性或多项式模型拟合，其中校正相关系数R2和显著性水平（P）均满足要求，结果具有统计学意义（P＜0.05），对应的拟合方程如下：

在软件上，将油相的质量占比Woil（X1）和表面活性剂与助表面活性剂质量之比Km（X2）分别对Agm-SMEDDS的平均粒径、PDI和载药量进行二维等高线图和三维效应面图绘制，相应结果见图2～4。

图2 Agm-SMEDDS平均粒径的二维等高线图和三维效应面图Fig 2 Response surface graph（2D and 3D）of the partical size of Agm-SMEDDS

由图2可知，当油相质量占比Woil（X1）一定时，Agm-SMEDDS的平均粒径随着表面活性剂与助乳化剂质量之比Km（X2）的增加先减小再增大；而当Km小于5时，平均粒径随着Woil的增加先增大后减小，当Km大于5时，平均粒径随着Woil先减小后增大。由图3可知，Agm-SMEDDS的PDI随着Woil增大而增大，随着Km的增大而减小。由图4可知，当Woil和Km均较低时，Agm-SMEDDS的载药量较低；而当Km大于5时，载药量均较高。

图3 Agm-SMEDDS的PDI的二维等高线图和三维效应面图Fig 3 Response surface graph（2D and 3D）of the drug loading of Agm-SMEDDS

图4 Agm-SMEDDS载药量的二维等高线图和三维效应面图Fig 4 Response surface graph（2D and 3D）of the drug loading of Agm-SMEDDS

综上，以油相质量占比Woil（X1）最大、粒径＜100 nm、PDI＜0.2、载药量最大为标准，进行最优处方筛选，优选三个解决方案：

①X1＝20.007，X2＝4.355，Y1＝15.78，Y2＝0.200，Y3＝120.354；

②X1＝19.714，X2＝4.070，Y1＝23.134，Y2＝0.200，Y3＝117.873；

③X1＝16.523，X2＝7.72，Y1＝15.78，Y2＝0.127，Y3＝123.513。

根据实际可操作性和表面活性剂比例不宜过高（X1定为20，Km定为4），因此推测最优处方为（Peceol∶1944cs＝1∶1）的质量占比为20%，RH40为64%，Transcutol HP为16%，进行下一步试验。

2.6 最优处方验证

按照最优处方（Peceol∶1944cs∶RH40∶ Transcutol HP＝10%∶10%∶64%∶16%）制备3批Agm-SMEDDS制剂，以“2.5”项下方法测定其平均粒径、PDI与载药量，观察实测值是否在预测范围内，结果见表5。结果表明，制剂处方测定值与软件的预测值相比差距较小，说明所建立的数学模型具有良好的预测性。

表5 星点设计-效应面优化法的验证试验(±s，n＝3) Tab 5 Verification experiment of central composite design and response surface optimization method (±s，n＝3)

表5 星点设计-效应面优化法的验证试验(±s，n＝3) Tab 5 Verification experiment of central composite design and response surface optimization method (±s，n＝3)

评价指标 预测值 实测值平均粒径/nm 15～23 17.62±0.39 PDI ＜0.2 0.067±0.050载药量/（mg·g-1） 117～120 121.10±1.43

2.7 透射微观形态

取Agm-SMEDDS 100 μL，缓慢加入10 mL纯化水中（100 r·min-1），形成澄清透明的阿戈美拉汀微乳液。取微乳液适量，滴在覆有支持膜的铜网上，静置10 min后用滤纸吸去多余液体，再滴加 2%的磷钨酸溶液，负染5 min，自然挥干，在透射电镜下观察，结果 Agm-SMEDDS经稀释后的乳滴主要呈圆球形，分布比较均匀（见图5）。

图5 Agm-SMEDDS的投射电镜图Fig 5 Transmission electron microscopy of Agm-SMEDDS

2.8 粒径分布与Zeta电位

取Agm-SMEDDS 100 μL，缓慢加入10 mL纯化水中（100 r·min-1），形成澄清透明的阿戈美拉汀微乳液。取微乳液适量，采用激光粒度分析仪测定空白自微乳和载药自微乳的平均粒径和Zeta电位，粒径成正态分布，Zeta电位值为（-0.969±9.27）mV，见图6。

图6 Agm-SMEDDS的粒径分布与Zeta电位Fig 6 Droplet size and Zeta potential of Agm-SMEDDS

2.9 浊点测定

移取200 μL自微乳浓缩液缓慢加入20 mL蒸馏水中（37℃空气浴，缓慢搅拌），梯度升温（2℃·min-1），溶液出现浑浊时的温度即为浊点温度。

在试验中发现，当溶液体系低于60℃时，溶液的外观无明显变化，2℃·min-1梯度升温时，溶液从澄清到微微泛蓝光，再到出现蓝白色浑浊，浊点温度约为72℃，此温度明显高于37℃，表明自微乳进入胃肠道后不会发生相分离，不会影响药物的释放及吸收。

2.10 不同介质及稀释倍数下的稳定性

移取适量自微乳浓缩液，按1∶10、1∶50、1∶100、1∶200的比例用pH 1.0、pH 4.5、pH 6.8、纯化水稀释乳化（37℃空气浴，100 r·min-1），考察其对自微乳乳滴粒径和多分散指数 PDI的影响，结果均无明显影响，见图7。

图7 不同介质及稀释倍数对自微乳乳滴粒径（A）和多分散指数 PDI（B）的影响Fig 7 Effect of different medium with different dilution ratios on droplet size（A）and polydispersion index（PDI）（B）of selfmicroemulsion

2.11 不同介质及放置时间下的粒径稳定性

移取100 μL自微乳浓缩液，按1∶100的比例用pH 1.0、pH 4.5、pH 6.8、纯化水稀释乳化（37℃空气浴，100 r·min-1），考察放置0、3、6 h对自微乳乳滴粒径的影响，结果见表6。各试验条件下自微乳乳滴粒径变化情况较小，且6 h后依旧未观察到制剂有分层、浑浊和沉淀等现象（见图8），表明制备的Agm-SMEDDS较稳定。

图8 制备0 h（A）和6 h（B）后微乳的外观Fig 8 Appearance of microemulsion prepared after 0 h（A）and 6 h（B）

表6 不同介质中不同放置时间的粒径稳定性 Tab 6 Stability of droplet size in different media at different time

2.12 溶出试验

取阿戈美拉汀原料药25 mg和阿戈美拉汀自微乳525 mg（规格525 mg中含原料药 25 mg）分别填入0号胶囊中，再放入沉降篮中，照溶出度与释放度测定法（《中国药典》2020年版第四部通则0931第二法）[14]，以pH 1.0、pH 4.5、pH 6.8、水各500 mL为溶出介质，转速100 r·min-1，水浴温度（37±0.5）℃，依法操作，在5、10、15、20、30、45、60、90、120、150、180、240 min，分别取样5 mL，0.22 µm 微孔滤膜滤过并即时补充相同温度相同体积的溶出介质，取续滤液在 230 nm 处用HPLC-UV法测定含量，计算溶出度。

如图9所示，阿戈美拉汀以纳米乳滴的形式存在的自微乳相较于原料药，在pH 1.0、pH 4.5、pH 6.8、水中溶出均很快，5 min 内平均溶出度＞85%，而原料药溶出较慢，在桨法100 r·min-1，4 h才能溶出完全。溶出介质无浮油、无沉淀，说明乳滴没有发生破乳，药物没有析出。

图9 阿戈美拉汀原料药和自微乳在pH 1.0（A）、pH 4.5（B）、pH 6.8（C）、水（D）的溶出结果Fig 9 Dissolution of agomelatine API and self-microemulsion in pH 1.0（A），pH 4.5（B），pH 6.8（C）and water（D）

2.13 制剂影响因素考察

按照最优处方制备的Agm-SMEDDS制剂（Peceol∶1944cs∶RH40∶Transcutol HP＝10%∶10%∶64%∶16%，规格为25 mg/525 mg），其专属性色谱图见图10，放置在高温（60℃）、光照[（4500±500）lx]、避光（25℃）条件下，分别于0、5、10、30 d测定该制剂中药物的含量，结果见表7。

表7 不同条件下不同放置时间阿戈美拉汀含量变化(%，n＝3) Tab 7 Agomelatine content change under different factors at different time (%，n＝3)

图10中稀释剂为乙醇-乙腈＝1∶4，空白辅料为Peceol-1944cs-RH40-Transcutol HP＝10%∶ 10%∶64%∶16%，对照品为用稀释剂溶解的原料药，样品为最优处方制备的Agm-SMEDDS制剂，稀释剂及空白辅料在主峰处无干扰。

图10 Agm-SMEDDS制剂的专属性色谱图Fig 10 Chromatograms of Agm-SMEDDS

如表7所示，Agm-SMEDDS制剂受高温和强光影响较小，0、5、10、30 d测定该制剂含量未发生明显变化，表明该制剂较稳定。

3 讨论

在本研究的三元相图试验中发现，当选择溶解度大的辅料作为处方的成分时，其形成的微乳面积并不是最大的，而微乳面积越大制剂越稳定，可见部分已报道文献中仅仅依靠溶解度筛选自微乳处方并不是较理想的方式。溶解度大的辅料，包括油相、表面活性剂、助表面活性剂，若选择溶解度较大的油相，可能会面临该油相不易被表面活性剂所乳化的问题，而溶解度相对较小的其他油相更易被乳化，从而溶解度较大的油相其形成微乳面积并不一定是最大的；若选择溶解度较大的表面活性剂和助表面活性剂，它们存在一定的亲水性，药物在形成自微乳的过程中会面临析出风险，则制剂的粒径就不满足要求，微乳面积也会减小。因此，在选择制剂处方时，需要结合油相、表面活性剂、助乳化剂的综合作用来考察。在进行星点设计效应面时，将阿戈美拉汀溶解于处方中进行设计，而非单纯的空白辅料，是考虑到药物的存在[12]会影响粒径和PDI的结果，从而干扰最终处方的筛选，选择与市售的阿戈美拉汀片剂相同剂量（25 mg）的药物进行试验，更能反映真实的需求。

本文考察了制备的Agm-SMEDDS在pH 1.0、pH 4.5、pH 6.8、水的不同稀释倍数1∶10、1∶50、1∶100、1∶200下的粒径稳定性，没有考察1∶500、1∶1000[15]的稀释倍数，是因为在人体内平均胃液量为50 mL，且乳化时间在2 min以内，在如此短的时间内人体无法拥有相应稀释倍数的环境，考察高比例稀释倍数并没有太大的意义。放置0、3、6 h，分散后依旧可以形成平均粒径约为20 nm、PDI小于0.2的微乳。较低的PDI值表明较难发生奥斯特瓦尔德熟化[16]，纳米乳液粒径分布紧密，稳定性较好。与其他文献相比，本文开展的溶出试验不仅考察了水介质，还进行了pH 1.0、pH 4.5、pH 6.8，能更好地反映阿戈美拉汀自微乳在不同pH的溶出情况，更接近人体的胃肠道环境。溶出介质无浮油无沉淀，说明乳滴没有发生破乳，药物包裹在乳滴中，一方面可以增大药物的溶解度，另一方面可以减少胃肠道酶的代谢[17]，增加淋巴转运，且制剂所含的辅料已为药用级辅料，该制剂在高温、强光条件下含量也未发生变化，这些均有利于制剂后期的工业化开发。但其体内行为有待进一步研究。