下调DNA 损伤激活的长链非编码RNA 抗心房颤动大鼠心肌纤维化的机制研究

杨淑玲，谷云飞，杨定宪，高爱玲，尚伟，陈滢伊，张光

心房颤动（房颤）是常见的室上性心律失常，发生率较高，严重时可导致心力衰竭[1-2]。其病因复杂，与心房肌电重构、结构重塑和自主神经失调有关；其中心肌纤维化导致的结构重塑是房颤重要的病理生理因素[3]。心房炎症与心肌纤维化密切相关[4-5]。

丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）通路的激活在心房纤维化中起着核心作用[6]，p38 丝裂原激活的蛋白激酶（p38 MAPK）/核因子κB（NF-κB）通路是体内重要的炎症通路，与房颤和不良的心房纤维化有关[7]。

据报道，长链非编码RNA（lncRNA）在结构重塑和肌电重构中起着重要作用，如lncRNA H19[8]和lncRNA MIAT[9]与心脏纤维化相关。有报道称，DNA损伤激活的长链非编码RNA（lncRNA NORAD）在急性心肌梗死中上调，可促进心肌纤维化和细胞凋亡，敲低其表达可减少梗死面积和纤维化改善病情[10]；还可抑制高糖诱导的人肾小球系膜细胞纤维化和心肌细胞凋亡[11-12]。然而，lncRNA NORAD 在房颤诱导的心肌纤维化中的作用仍未明确。因此，本研究旨在探究lncRNA NORAD 对房颤大鼠心肌纤维化的影响及潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性SD 大鼠48 只，体质量200～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

将大鼠饲养在12 h 光照间隔12 h 黑暗、温度（23±2）℃、相对湿度45%～60%的房间中，自由饮食和摄水。

1.2 药品、试剂及仪器

乙酰胆碱（ACh）、氯化钙（CaCl2）（Sigma-Aldrich 公司，美国）；重组腺相关病毒血清型9（rAAV9）载体含用于沉默DNA 损伤激活的长链非编码RNA 的小干扰RNA（rAAV9-siNORAD）基因及其阴性对照（rAAV9-NC）、实时荧光定量PCR引物（GenePharm 公司，中国）；p38 MAPK 抑制剂SB203580（Med Chem Express 公司，美国）；RIPA裂解液、BCA 试剂盒（碧云天生物科技公司，中国）；Masson 三色染色试剂盒（Solarbio 公司，中国）；总RNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司，中国）；双链DNA 染料试剂（SYBR Green）（上海联迈生物工程有限公司，中国）；肌酸激酶同工酶（CKMB）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）ELISA 检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，中国）；兔源一抗丝裂原活化蛋白激酶激酶6（MKK6）、p38MAPK、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、β-肌动蛋白（β-actin）及二抗辣根过氧化酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG（Abcam 公司，英国）。

NanoDrop 2 000 分光光度计（Thermo Scientific公司，美国）；ABI 7 500 实时荧光定量PCR 仪系统（美国应用生物系统公司）；动物心电图系统（Nasiff Associates 公司，美国）；iMark680 多功能酶标仪、蛋白转膜装置（Bio-Rad 公司，美国）；BX61 电动显微镜（Olympus 公司，日本）。

1.3 方法

分组及建模：rAAV9-siNORAD 及其阴性对照（rAAV9-NC）用于实验干预。SD 大鼠随机分为对照组、房颤组、rAAV9-NC 组、rAAV9-siNORAD 组、SB203580 组 和rAAV9-siNORAD+SB203580 组，每组8 只。除对照组外，各组大鼠每天经尾静脉以1 ml/kg 的剂量注射ACh-CaCl2混合液（60 μg/ml ACh和10 mg/ml CaCl2），共7 d，诱导建立房颤模型[13]。于实验前、建模后观察并记录大鼠的心电图，若房颤大鼠出现P 波消失，代替为小f 波，频率在350～600 次/min 的典型房颤心电图，说明大鼠房颤模型制备成功[13]。

建模后，rAAV9-NC 组 和rAAV9-siNORAD组大鼠尾静脉分别注射rAAV9-NC 和rAAV9-siNORAD（2×1011个载体基因组颗粒/每只大鼠）；SB203580 组大鼠给予1 mg/kg 的SB203580 尾静脉注射；rAAV9-siNORAD+SB203580 组大鼠经尾静脉注射1 mg/kg 的SB203580 和rAAV9-siNORAD，1 次/d，连续14 d。

心电图记录与分析：实验前和建模后，戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射使大鼠麻醉。将12 导联心电图的四肢导联插入动物的四肢中，连接心电图仪（纸速50 mm/s，电压10 mm/mV），记录各组大鼠心电图变化，记录并排除非窦性心律。实验第22 d，再次对大鼠进行心电图测试，记录房颤的发生率和持续时间。

检测血清心肌酶和炎性因子水平：心电图检测完成后，腹主动脉取血，静置后以1 617 g 离心15 min，分离血清，按照ELISA 检测试剂盒说明书的操作检测CK-MB、cTnI、TNF-α、IL-6 水平[14]。具体操作为：将50 μl 的大鼠血清加入包被的96 孔板的每个孔中，然后在37℃下孵育60 min。反应结束后，用洗涤缓冲液洗涤孔3 次，然后在每个孔中加入HRP 标记的抗体，37℃孵育30 min。弃去孔内液体，用洗涤缓冲液洗涤孔3 次，再向每孔加入底物A、B 各50 μl，混匀后37℃避光温育10 min。最后加入终止缓冲液，在450 nm 波长处测量光密度（OD），根据标准曲线，计算CK-MB、cTnI、TNF-α 和IL-6 水平。

Masson 染色检测心房组织纤维化：取大鼠心脏，用磷酸盐缓冲液（PBS）（主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl 和KCl，pH 7.4）洗涤血液。分离左心房组织，并分为三部分，两部分于-80℃冰箱保存，分别用于实时荧光定量PCR 和蛋白免疫印迹（Western blot）实验；最后一部分用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，进行Masson 三色染色，在光学显微镜下观察胶原蛋白沉积，计算心房胶原容积分数（CVF）[15]。胶原纤维染成蓝色。每个样品选择三个视野，用Image-Pro Plus 6.0 软件分析结果。CVF（%）=心肌胶原纤维面积/所测视野面积×100%。

实时荧光定量PCR 检测心房组织lncRNA NORAD、Ⅰ型胶原（COL1-A1）和Ⅲ型胶原（COL3-A1）mRNA 表达：取-80 ℃冰箱保存的部分左心房组织。用总RNA 提取试剂盒提取总RNA。使用分光光度计对总RNA 进行定量检测。按照试剂盒说明书进行逆转录。收集cDNA 用于实时荧光定量PCR 扩增[16]。反应体系（20 μl）：cDNA（200 ng/μl）2 μl，SYBR®Premix Ex TaqTM（2×）10 μl，上下游引物（引物序列见表1）各0.4 μl，ddH2O 7.2 μl。反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性10 s，60℃退火60 s，72℃延伸60 s，进行40个循环。使用2-ΔΔCT方法以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参对照计算目的基因的相对表达量。

表1 引物序列及产物长度

Western blot 检测心房组织p38 MAPK/NF-κB通路相关蛋白表达：剩余左心房组织在RIPA 裂解液中裂解，4℃，12 000 g 离心15 min。收集上清液，BCA 法测定蛋白质浓度。取等量蛋白样品通过SDS-PAGE 电泳分离，并转移到PVDF 膜上。然后，将膜封闭并与一抗（MKK6、p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、p-NF-κB p65、β-actin，1：1 000）在4℃下孵育过夜。次日将膜用含Tween-20的TBST 缓冲液（主要成分为50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、0.05% Tween-20，pH 8.0）洗涤3 次，每次10 min，然后在室温下与HRP 标记的羊抗兔IgG 二抗（1：4 000）在黑暗中孵育1 h。最后，增强化学发光法（ECL）显色，凝胶成像仪观察蛋白条带并拍照，分析结果，β-actin 为内参对照。

1.4 统计学方法

数据使用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析，计量资料以均值±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行LSD-t检验；计数资料以例（%）表示，差异比较行卡方检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠房颤的发生率和持续时间的比较

心电图结果显示，实验前各组大鼠的心律正常；建模后，对照组大鼠可观察到规则的P 波，心律正常；房颤大鼠可观察到P 波消失，出现大小不等、不规则的f 波，R-R 间期变化不规则，提示成功建立了房颤模型（图1）。实验结束后，与房颤组相比，rAAV9-siNORAD 组和SB203580 组大鼠房颤的发生率均降低，且持续时间均明显缩短（P均＜0.05）；与rAAV9-siNORAD 组 和SB203580 组相比，rAAV9-siNORAD+SB203580 组大鼠房颤的发生率均降低，持续时间明显缩短（P均＜0.05，表2）。

图1 正常大鼠及心房颤动大鼠心电图

表2 实验结束后各组大鼠房颤发生率和持续时间比较（）

表2 实验结束后各组大鼠房颤发生率和持续时间比较（）

注：房颤：心房颤动；rAAV9-NC：重组腺相关病毒血清型9 阴性对照；rAAV9-siNORAD：重组腺相关病毒血清型9 载体含用于沉默DNA 损伤激活的长链非编码RNA 的小干扰RNA；SB203580：p38 丝裂原激活的蛋白激酶抑制剂。与对照组比 *P＜0.05；与房颤组比△P＜0.05；与rAAV9-siNORAD 组比 ▲P＜0.05；与SB203580 组比 #P＜0.05

2.2 各组大鼠血清CK-MB、cTnI、炎性因子水平的比较（表3）

表3 各组大鼠血清CK-MB、cTnI、炎性因子水平比较（）

表3 各组大鼠血清CK-MB、cTnI、炎性因子水平比较（）

注：房颤：心房颤动；rAAV9-NC：重组腺相关病毒血清型9 阴性对照；rAAV9-siNORAD：重组腺相关病毒血清型9 载体含用于沉默DNA 损伤激活的长链非编码RNA 的小干扰RNA；SB203580：p38 丝裂原激活的蛋白激酶抑制剂：cTnI：心肌肌钙蛋白I；CK-MB：肌酸激酶同工酶；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-6：白细胞介素-6。与对照组比*P＜0.05；与房颤组比△P＜0.05；与rAAV9-siNORAD 组比较 ▲P＜0.05；与SB203580 组比较#P＜0.05

与对照组相比，房颤组大鼠血清CK-MB、cTnI、TNF-α、IL-6 水平均明显升高（P均＜0.05）；与房颤组相比，rAAV9-siNORAD 组和SB203580 组大鼠血清CK-MB、cTnI、TNF-α、IL-6 水平均明显降低（P均＜0.05）；与rAAV9-siNORAD 组和SB203580 组相比，rAAV9-siNORAD+SB203580 组大鼠血清CKMB、cTnI、TNF-α、IL-6 水平均明显降低（P均＜0.05）。

2.3 各组大鼠心房组织纤维化比较

Masson 染色结果显示，房颤组大鼠的心房组织有明显的纤维化改变，胶原纤维增生，排列紊乱，CVF 较对照组明显增加[（35.29±5.35）%vs.（1.41±0.23）%，P＜0.05]，房颤组和rAAV9-NC 组CVF[（32.63±4.82）%]及在心脏间质和血管周围组织的纤维化方面差异均无统计学意义。与房颤组相比，rAAV9-siNORAD 组和SB203580 组大鼠心房组织均可见蓝染的胶原纤维减少，CVF 分别为（21.48±2.79）%、（24.15±2.86）%均明显降低（P均＜0.05）；与rAAV9-siNORAD 组和SB203580 组相比，rAAV9-siNORAD+SB203580 组大鼠心房组织均可见蓝染的胶原纤维最少，CVF[（14.36±2.20）%]明显降低（P均＜0.05），见图2。

图2 各组大鼠心房组织Masson 染色（×200）

2.4 各组大鼠心房组织lncRNA NORAD、COL1-A1和COL3-A1 的mRNA 表达比较（表4）

表4 各组大鼠心房组织lncRNA NORAD、COL1-A1 和COL3-A1 的mRNA 表达比较（）

表4 各组大鼠心房组织lncRNA NORAD、COL1-A1 和COL3-A1 的mRNA 表达比较（）

注：房颤：心房颤动；rAAV9-NC：重组腺相关病毒血清型9 阴性对照；rAAV9-siNORAD：重组腺相关病毒血清型9 载体含用于沉默DNA 损伤激活的长链非编码RNA 的小干扰RNA；SB203580：p38 丝裂原激活的蛋白激酶抑制剂；lncRNA NORAD：DNA 损伤激活的长链非编码RNA；COL1-A1：Ⅰ型胶原；COL3-A1：Ⅲ型胶原。与对照组比*P＜0.05；与房颤组比△P＜0.05；与rAAV9-siNORAD 组比较▲P＜0.05；与SB203580 组比#P＜0.05

与对照组相比，房颤组大鼠心房组织lncRNA NORAD、COL1-A1 和COL3-A1 的mRNA 水平明显升高（P均＜0.05）；与房颤组相比，rAAV9-siNORAD组和SB203580 组大鼠心房组织lncRNA NORAD、COL1-A1 和COL3-A1 的mRNA 水平明显降低（P均＜0.05）；rAAV9-siNORAD 组 和SB203580 组相比，rAAV9-siNORAD+SB203580 组大鼠心房组织COL1-A1和COL3-A1 的mRNA 水平明显降低（P均＜0.05）。

2.5 各组大鼠心房组织p38 MAPK/NF-κB 通路相关蛋白表达比较（图3）

图3 各组大鼠心房组织p38 MAPK/NF-κB 通路相关蛋白水平比较

与对照组相比，房颤组大鼠心房组织MKK6 蛋白水平、p-p38 MAPK/p38 MAPK 和p-NF-κB p65/NF-κB p65 的比值均明显升高（P均＜0.05）；与房颤组相比，rAAV9-siNORAD 组和SB203580 组大鼠心房组织MKK6 蛋白水平、p-p38 MAPK/p38 MAPK和p-NF-κB p65/NF-κB p65 的比值均明显降低（P均＜0.05）；与rAAV9-siNORAD组和SB203580组相比，rAAV9-siNORAD+SB203580 组大鼠心房组织MKK6蛋白水平、p-p38 MAPK/p38 MAPK 和p-NF-κB p65/NF-κB p65 的比值均明显降低（P均＜0.05）。

3 讨论

近年来，研究证实lncRNA 参与房颤的进展，并在心房纤维化中起重要作用，lncRNA NORAD 与心肌细胞损伤和心肌纤维化密切相关[10-12]。尾静脉注射ACh-CaCl2属于药物诱导建模，是目前建立房颤模型常用方法[13,17]，而且有报道称，ACh-CaCl2建模后大鼠心房出现纤维化改变[13]。因此，本研究采用此方法成功建立了大鼠房颤模型，并在房颤大鼠中观察到lncRNA NORAD 上调，血清心肌损伤标志物（cTnI、CK-MB）和炎性因子（TNF-α、IL-6）水平升高，纤维化标志物胶原蛋白表达也上调，并且心房纤维化的程度增加。这提示，lncRNA NORAD的升高可能与房颤大鼠心房纤维化程度有关。

腺相关病毒（AAV）可用于在体内基因转移实验，且不同血清型对组织器官的嗜性各有不同，其中AAV9 在全身具有更广泛的表达分布，对心脏具有明显亲和性，已被广泛使用[18-19]。本研究采用rAAV9-siNORAD 注射到大鼠体内以敲低lncRNA NORAD，结果显示敲低lncRNA NORAD 可以降低房颤的发生率和持续时间，并降低COL1-A1 和COL3-A1 的mRNA 水平以及血清心肌损伤标志物和炎性因子水平，减轻心房纤维化。提示下调lncRNA NORAD 可减轻房颤大鼠心房纤维化。

炎症介导的心肌纤维化在房颤发展中起关键作用[20]。p38 MAPK 是MAPK 家族控制炎症反应最重要的成员，参与心脏重塑过程中与肥大和炎症相关的有害信号通路的激活，并参与心肌成纤维细胞中基质金属蛋白酶和胶原蛋白的调节[21-22]。在细胞受到刺激后，NF-κB p65 可发生磷酸化，上调IL-6 和TNF-α 水平，加剧心肌梗死后的炎症反应和心肌纤维化程度[23]。而且在心肌梗死后发生房颤的大鼠模型中，NF-κB p65 和p38 MAPK 的磷酸化水平增加，降低其磷酸化水平可缓解心肌梗死诱导的房颤的发生率和持续时间[7]。MKK6 是一种负责p38 MAPK 磷酸化的重要MAPK 激酶，可在应激刺激后激活p38 MAPK。本研究结果显示，房颤大鼠心房组织中MKK6 蛋白和p-p38 MAPK/p38 MAPK 和p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值升高；说明房颤中p38 MAPK/NF-κB p65 通路被激活。敲低lncRNA NORAD 后，房颤大鼠心房组织MKK6 蛋白和p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值明显降低，且与单独应用p38 MAPK 抑制剂SB203580 作用效果相似；且SB203580 和rAAV9-siNORAD 的联合应用对p38 MAPK/NF-κB p65 通路和心肌纤维化的抑制作用优于两者单独应用。提示，下调lncRNA NORAD 可能通过抑制p38 MAPK/NF-κB p65 通路激活对房颤大鼠发挥抗心肌纤维化作用。

综上所述，下调lncRNA NORAD 可减轻房颤大鼠心肌纤维化，其作用机制可能与抑制p38 MAPK/NF-κB p65 通路有关。本研究仅从动物水平上进行了初步探究，下一步将从体外细胞水平论证结果，并对右心房病理学变化深入观察探究。此外，由于NORAD 为非编码RNA，存在多个靶点，多方面调控的作用，是否能通过其他通路发挥作用，需进一步探索。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突