CLDN9与TYK2在无功能性垂体腺瘤的表达及与侵袭性的相关性

阿卜杜喀迪尔·牙森 巴 图 张 诚 麦麦提依明·托合提 吴永刚

新疆维吾尔自治区人民医院，新疆乌鲁木齐 830001

无功能性垂体腺瘤（non-functioning pituitary adenoma，NFPA）是垂体腺瘤的常见类型，约占30%［1］。因其常侵袭至海绵窦、视神经等重要邻近组织，手术难以全切，导致术后复发率高达58%［2］。由于NFPA侵袭性相关的病理机制尚未明确，缺乏有效的药物或其他治疗方法。放射治疗的有效性和安全性也不容乐观［3］。因此，深入研究NFPA侵袭性相关的病理分子机制和相关基因，对寻找更理想的治疗方法意义深远。

Claudins（CLDNs）包括27个家族成员，是作为细胞紧密连接（tight junction，TJ）的重要构成部分，对维持细胞稳定性和极性至关重要［4］，其异常表达（下调或上调）可促进或抑制多种肿瘤的恶性进展［5-6］，如CLDN1、CLDN7、CLDN3、CLDN6 等在乳腺癌、食管癌、前列腺癌、肺癌等肿瘤组织中表达下调，而CLDN3、CLDN4、CLDN9、CLDN17 等在卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肝癌等肿瘤组织中表达上调并促进其侵袭性，与不良预后有关［5-6］。因此，CLDNs 的异常表达被认为肿瘤恶性进展的重要机制之一［7］。此外，Janus 激酶（the Janus kinase，JAK）蛋白（包括JAK1/JAK2/JAK3 及TYK2 等4 个成员）在细胞信号转导通路中起到“桥梁”作用，在相应细胞因子及受体的作用下将细胞外的信号传递到细胞内［8］。酪氨酸激酶2（tyrosine kinase 2，Tyk2）作为JAK蛋白的重要成员，在多种肿瘤发生、进展中可见其异常表达或激活，因此TYK2被认为与肿瘤进展有关的致癌基因［9-10］，如TYK2 在卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、肝癌等多种肿瘤中的表达增高与这些肿瘤恶性进展有关［9-10］。

相关研究表明，TYK2 的异常表达或激活与CLDNs 促进肿瘤侵袭性作用有关，如高表达的CLDN9/CLDN17/CLDN12促进肝癌、肺癌等肿瘤的浸润性生长作用与高表达的TYK2有关［11-13］。可见，以此角度为切入点的研究可能为NFPA 侵袭性相关的病理机制及治疗方向能够提供有价值的研究基础，但此方面的研究鲜见报道。本课题组前期研究发现CLDN9 在垂体腺瘤中高表达［14］。本研究分析CLDN9、TYK2 在NFPA 组织中的表达量与侵袭性的相关性，初步探讨CLDN9 在NFPA 中的过表达与TYK2的相关性。

1 材料与方法

1.1 NFPA组织标本及储存垂体腺瘤组织标本来自2020-06—2021-05 在新疆维吾尔自治区人民医院神经外科住院接受经鼻蝶垂体瘤切除术的24 例NFPA 患者，其中男14 例，女10 例，年龄27～82（49.3±16.7）岁。收集其基本信息、术前激素水平、术前垂体磁共振检查、术中所见信息、术后病检结果等。根据术前影像检查及术中所见信息分为侵袭性NFPA 组和非侵袭性NFPA 组各12 例。纳入标准：（1）术前未接受任何治疗；（2）无内分泌疾病或长期激素服用史；（3）临床表现、术前内分泌激素及术后病理免疫组化结果均支持NFPA 诊断标准；（4）由同一术者以同样的方式获取肿瘤组织。排除标准：（1）复发性PA 患者；（2）资料不全患者；（3）有其他肿瘤病史的患者。符合以下标准的任何一条可诊断为侵袭性PA：（1）术前MRI 检查符合Knosp 分类Ⅳ级［15］；（2）术前MRI检查符合Knosp分类Ⅲ级［15］和术中可见向鞍旁海绵窦或鞍底骨质或向鞍上的侵袭性生长情况。用于实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）和蛋白质印迹（Western blot，WB）的标本在—80 ℃冷冻后储存于液氮中；用于免疫组化（immunohistochemistry，IHC）的标本以4%甲醛固定石蜡包埋后储存于本院病理科。本研究符合《赫尔辛基宣言》原则（www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/index.html）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及质粒转染：大鼠垂体瘤GT1-1细胞株（Procell 中国武汉生命科技有限公司）培养于含10%胎牛血清（Gibco上海素尔生物科技有限公司）+1%的100 U/mL 青霉素和链霉素的基础培养基（Procell 中国武汉生命科技有限公司）中，培养于37 ℃，5% CO2的培养箱中。取15 μL 处于对数生长期的GT1-1 细胞悬液进行计数，分别以1.5×105个细胞/24 孔板的孔进行铺板，铺板过夜培养后，进行质粒转染。按lipofectamine 3000 转染试剂盒（美国Invitrogen 公司）将空载质粒（NC 组）和CLDN9 质粒（OE-CLDN9 组）（中国优宝生物公司）分别转染至GT1-1细胞，再培养48 h后备用。

1.2.2 qRT-PCR：使用Trizol 试剂盒（美国Invitrogen公司）提取各组组织和细胞的总RNA，按照逆转录试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）说明书将其逆转录为cDNA，按照SYBRGreen PCR 试剂盒（中国北京全式金生物技术有限公司）说明书对各基因进行扩增。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共循环40次。以β-action作为内参照。引物序列：CLDN9：正向5′-CCTTTCGACCTT GGCCTGAT-3′ ，反向5′-GGGGGAGAACATCAAAGG GG-3′ ；TYK2：正向5′-CAGCCCCGTGTTCTGGTAT G-3′ ，反向5′-GAAAGGACGCCTCTGTCTCC-3′ ；βactin：正向5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，反向5′-TTTAATGTCACGCACGA TTTC-3′。用2-△△CT法计算各组目的基因的mRNA表达量。

1.2.3 IHC：将厚度5 μm的石蜡切片放入68 ℃培养箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）30 min进行烤片，用二甲苯和乙醇进行脱蜡。在组织上滴加3%过氧化氢，室温下孵育10 min。将切片加热，冷却后用蒸馏水冲洗2 次，用PBS 缓冲液（北京索莱宝科技有限公司）洗3 次。将用5%胎牛血清（Gibco 上海素尔生物科技有限公司）和PBS 缓冲液配好的封闭液滴加到组织上，放入37 ℃培养箱封闭30 min。用封闭液稀释的一抗（兔抗多克隆CLDN9 抗体，1 ∶200，美国NOVUSBIO 公司；兔抗多克隆TYK2 抗体，1∶200，武汉爱博泰克生物科技有限公司）加到组织切片上，4 ℃过夜孵育，用PBS 洗3 次。滴加用HRP 标记的二抗，37 ℃孵育30 min，用PBS 洗3 次。将配好的DAB显色剂（上海Beyotime公司）滴加在组织切片上。将组织切片放入苏木素（北京索莱宝科技有限公司）中染1～2 min，用自来水冲洗。梯度乙醇（北京索莱宝科技有限公司）脱水，用中性树胶（北京索莱宝科技有限公司）封片，固化后拍片。采用Image Pro Plus6.0（Media Cybernetics）软件，计算各组切片平均光密度值（AOD），进行定量分析。

1.2.4 WB：将在液氮下研磨后的各组肿瘤组织和转染48 h 后的各组细胞加入到RIPA 高效组织/细胞裂解液（北京索莱宝科技有限公司）进行裂解，在4 ℃下以12 000 r/min 离心15 min，离心完成后取上清，用BCA 蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）进行蛋白定量。取适量上样量，进行PVDF（Millipore 上海玉博生物科技有限公司）转模，用5%脱脂牛奶进行封闭，室温下孵育1 h。加入到一抗（兔抗多克隆CLDN9 抗体，1 ∶10 000，美国NOVUSBIO 公司；兔抗多克隆TYK2 抗体，1∶10 000，武汉爱博泰克生物科技有限公司）孵育10 min，4 ℃过夜。用TBST（北京索莱宝科技有限公司）洗膜3次，每次10 min。加入到二抗（1∶20 000），室温下孵育1 h。将ECL加到膜上后，用化学发光成像系统曝光，出现蛋白条带，保存图片，用Image J软件分析各条带灰度值，以目的蛋白和内参蛋白灰度值的比值进行蛋白水平的比较。

1.3 统计学分析使用SPSS 25.0 和GraphPad Prism 7.0软件对数据进行统计学分析和相关分析图的绘制。符合正态及近似正态分布的定量数据以均数±标准差（±s）表示，组间两两比较采用独立样本t检验，多重比较采用双因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CLDN9 在侵袭性NFPA 组织中的表达qRT-PCR 检测结果显示，CLDN9 在侵袭性NFPA 组织中的mRNA水平明显高于非侵袭性NFPA组织，差异有统计学意义（P＜0.001）；IHC、WB 检测结果显示，CLDN9 蛋白主要在细胞核表达，在侵袭性NFPA组织中的表达量明显高于非侵袭性NFPA组织，差异有统计学意义（P＜0.001 或0.05）。CLDN9 在NFPA组织中表达如表1和图1所示。

图1 CLDN9在NFPA组织中的表达Figure 1 The expression levels of CLDN9 in NFPA tissues

表1 CLDN9在2组NFPA组织中的表达水平 （±s）Table 1 CLDN9 expression level in two groups of NFPA （±s）

表1 CLDN9在2组NFPA组织中的表达水平 （±s）Table 1 CLDN9 expression level in two groups of NFPA （±s）

组别qRT-PCR IHC WB非侵袭性NFPA组侵袭性NFPA组t值P值1.04±0.03 2.23±0.23 12.63＜0.001 2 294.50±154.92 4 086.78±188.79 17.98＜0.001 0.85±0.17 1.24±0.34 2.45 0.032

2.2 TYK2 在侵袭性NFPA 组织中的表达qRT-PCR 检测结果显示，TYK2 在侵袭性NFPA 组织中的mRNA水平明显低于非侵袭性NFPA组织，差异有统计学意义（P＜0.001）。IHC、WB检测结果显示，TYK2主要在细胞质中表达，胞外基质也有少量表达，在侵袭性NFPA 组织中的表达量明显低于非侵袭性NFPA 组织，差异有统计学意义（P＜0.01 或0.05）。TYK2在NFPA组织中的表达如表2和图2所示。

图2 TYK2在NFPA组织中的表达Figure 2 The expression levels of TYK2 in NFPA tissues

表2 TYK2在2组NFPA组织中的表达水平 （±s）Table 2 TYK2 expression level in two groups of NFPA （±s）

表2 TYK2在2组NFPA组织中的表达水平 （±s）Table 2 TYK2 expression level in two groups of NFPA （±s）

组别qRT-PCR IHC WB非侵袭性NFPA组侵袭性NFPA组t值P值1.02±0.02 0.29±0.13 13.82＜0.001 6 380.89±714.23 4 884.89±468.32 4.29 0.002 0.78±0.19 0.57±0.12 2.26 0.047

2.3 CLDN9 过表达后的TYK2 表达量将空载质粒（NC）和CLDN9（OE-CLDN9）质粒转染后用WB 和qRT-PCR 检测2 组细胞中的CLDN9 水平，结果显示OE-CLDN9组中的表达明显高于NC组（P＜0.001，如表3和图3A～B），表示CLDN9过表达成功。接下来用qRT-PCR检测2组细胞中的TYK2水平，检测结果显示TYK2在OE-CLDN9组的表达量明显低于NC组（P＜0.01，如表3和图3C）。

表3 2组细胞中的CLDN9、TYK2表达水平 （±s）Table 3 CLDN9 and TYK2 expression levels in the two groups （±s）

表3 2组细胞中的CLDN9、TYK2表达水平 （±s）Table 3 CLDN9 and TYK2 expression levels in the two groups （±s）

组别CLDN9 TYK2 NC组OE-CLDN9组F值P值1.46±0.50 4 680.02±646.42 943.30＜0.001 1.03±0.14 0.85±0.12 13.64 0.004

3 讨论

NFPA 虽然是良性肿瘤，但因其侵袭性使其成为治疗棘手的神经外科疾病之一［16］。因此，NFPA侵袭性相关的研究是神经外科领域的热点之一。NFPA 的发生和发展是像其余肿瘤一样参与原癌基因的激活、抑癌基因的失活、激素的刺激、生长因子的增多、细胞信号通路的异常等复杂的过程［17-18］。本研究团队在前期研究中发现，CLDN9 是与垂体腺瘤发生有关的基因，在垂体腺瘤中的表达高于正常垂体组织［14］。本研究在此基础上进行进一步研究，以期为NFPA 侵袭性的病理机制提供有价值的参考。

CLDNs 蛋白作为维持上皮屏障的重要结构，异常表达与肿瘤发生和侵袭性增加密切相关［19］，如在前列腺癌中CLDN3/4 高表达，CLDN3/4 被敲除后前列腺癌细胞的侵袭能力和存活率降低［20］。此外，CLDNs 异常表达具有组织依赖性，在不同组织来源的肿瘤中出现不同的表达异常［21］，如在浆乳头状腺癌中，CLDN1 高表达，CLDN2 低表达。相反，在子宫内膜样增生组织中，CLDN1 低表达，CLDN2 高表达［22］。然而，CLDNs 与垂体腺瘤侵袭性相关的研究很少有报道。本研究中，与非侵袭性NFPA 组织相比，在侵袭性NFPA中CLDN9高表达，与本课题组前期得到的结果一致，即CLDN9 在垂体腺瘤中的表达高于正常垂体组织，在侵袭性垂体腺瘤中的表达量高于非侵袭性垂体腺瘤［14］。此外，KIM 等［23］也通过生物信息学发现高表达的CLDN9能够促进NFPA侵袭性。结合上述研究结果可以认为，过表达的CLDN9 与NFPA 侵袭性增加有关。CLDNs 蛋白的异常表达可能影响TJ 成分的正常组成比，导致其完整的构和功能发生变化，进一步导致细胞间隙增加，肿瘤细胞通过“松弛”的细胞间隙进行增殖［22］，从而导致NFPA 侵袭性增加。此外，异常表达的CLDNs 还通过诱导上皮向间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）促进肿瘤侵袭性和远处转移［24］。因此，敲除CLDN9 的异常表达是有望成为对NFPA 侵袭性的潜在治疗方法。

根据以往研究报道，在多种肿瘤中TYK2在多种细胞因子受体的作用下表达上调并与肿瘤恶性进展有关［10］。而本研究中在侵袭性NFPA 中TYK2 低表达。通过进一步查阅文献发现，在有些肿瘤样本或切片中TYK2的低表达被认为是不良预后的标志物［25］。有文献报道，TYK2的表达下调有助于乳腺癌局部转移［26］。关于肝细胞癌的一篇荟萃分析中提示，正常或高表达的TYK2 与患者更长的生存期有关［27］。相关文献中提到，TYK2 除致癌作用外，还介导干扰素（IFNs）、白介素-12（IL-12）等细胞因子起到免疫监视、促进凋亡、抗肿瘤增殖作用［28-35］。基于以上文献报道，考虑TYK2 在NFPA 中的表达可能与其免疫监视、抗肿瘤增殖作用有关，而低表达的TYK2 可能与NFPA侵袭性及不良预后有关。

为观察在NFPA 中高表达的CLDN9 与TYK2 有无关系，将CLDN9 和空载体稳定转染到垂体瘤GT1-1细胞系，构建CLDN9过表达的垂体瘤GT1-1细胞系。验证结果显示，在垂体瘤GT1-1 细胞系中CLDN9 过表达后TYK2 表达下调。因此，考虑在NFPA 中高表达的CLDN9 可能通过低表达的TYK2促进其侵袭性。相关研究表明，CLDNs 通过诱导EMT促进肿瘤侵袭性和远处转移［28，36］。EMT的发生依赖于TYK2 的异常表达/激活［28，37-38］。SUN 等［13］研究发现，CLDN12 在肺癌中的高表达通过TYK2 的异常表达诱导EMT，从而促进肺癌的转移。因此，在NFPA 中高表达的CLDN9 可能通过低表达的TYK2诱导EMT，从而促进NFPA 侵袭性，其具体机制需进一步研究证实。

高表达的CLDN9 与NFPA 侵袭性生长有关，其可能通过低表达的TYK2 促进NFPA 侵袭性。本研究具有样本量较小且实验内容较简单等局限性，需要进一步研究证实。本文为NFPA 侵袭性机制的进一步探索提供了初步的线索，有望成为NFPA侵袭性生长的预测因子及治疗靶点。