“独活-桑寄生”药对治疗膝骨性关节炎的药理学及分子对接分析

李家豪 谢芳 刘晓岚

（1 湖南中医药大学 长沙 410208；2 湖南省中医药研究院附属医院 长沙 410006；3 湖南中医药大学第二附属医院 长沙 410005）

骨性关节炎（Osteoarthritis, OA）是常见的退行性骨关节病，其发病与年龄、肥胖、性别、体质量以及外伤等多种因素有关[1～3]。OA 的病变常累及整个关节，如滑膜增生、骨赘形成、软骨下骨硬化，而进行性关节软骨破坏和细胞外基质合成代谢及分解代谢不平衡造成的软骨流失是最主要的病理表现[4～5]。据统计，在OA 发病人群中，膝骨性关节炎（Knee Osteoarthritis, KOA）发病率高达45%，远远高于其他类型的 OA，故 KOA 是最主要的 OA 类型[6～7]。KOA 主要的临床表现为膝关节疼痛、关节僵硬肿胀、关节周围肌肉力量及功能下降[8～9]，是导致中老年人残疾的主要原因之一[10]。有研究表明，KOA 影响着全球约2.5 亿人的生活，每年带来的医疗开支超过 891 亿美元[11～12]，可见 KOA 不仅严重危害人类健康，还给社会经济造成巨大负担。然而，由于KOA的发病机制非常复杂，到目前为止，临床仍然缺乏治愈KOA 或完全阻止KOA 疾病发展的方法[13]。西医从KOA 的病理特点出发，形成了以抗炎止痛、营养关节软骨及手术干预的系统治疗方案，能在一定程度上缓解疼痛和改善膝关节活动度，但也存在远期疗效不佳、手术风险及后遗症等不足之处[14]。中医治疗KOA 有独特的认识，针对KOA 的发病特点及临床症状表现形成了以补益肝肾、活血化瘀为代表的治疗方法和理论体系。中医药治疗KOA 临床疗效确切，在临床中应用广泛，且患者的接受程度较高。

独活与桑寄生是独活寄生汤中的经典药对，广泛应用于肝肾不足型KOA 的治疗。邵先舫教授以独活寄生汤为基础，结合自己临床用药经验创制的活膝汤在KOA 治疗的临床应用中，疗效优良，其组方中也采用“独活-桑寄生”药对，配伍以奏祛风除湿、补益肝肾之效，协同发挥治疗KOA 的作用。由于天然药物调控机制的复杂性，“独活与桑寄生”对KOA 的具体调控机制仍有待我们探索与研究。网络药理学是在系统生物学的理论基础上，利用数据网络分析生物系统和药物分子的新型学科[15]。2007年，李梢提出生物网络与中药方剂两者相结合的观点[16]，随着医学科学的日益发展，人们发现基于网络药理学识别药物中的化合物成分及靶点，能更准确合理地指导药物在临床治疗中使用。近年来，网络药理学成为了一种可以系统、有效揭示中医药方剂中分子作用机制的方法[17]。本研究以网络药理学技术为依据，探讨独活与桑寄生的有效成分、潜在的作用机制及靶点，预测独活与桑寄生干预KOA 的潜在靶点及作用机制，为“独活-桑寄生”药对防治KOA的进一步研究提供依据和借鉴。现报道如下：

1 工具与方法

1.1 药对的活性成分及作用靶点筛选 基于TCMSP 数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），检索出独活与桑寄生的药物活性成分，筛选出类药性（Drug-likeness,DL）≥0.18，且口服生物利用度（Oral Bioavailability,OB）≥30%的活性成分，同时查找得到相应的作用靶点。应用Perl 插件删除重复靶点，得到独活-桑寄生药对有效成分作用靶点。

1.2 KOA 作用靶点筛选 以“Knee Osteoarthritis”为检索词，在 GeneCards（https://www.genecards.org/）和 OMIM（https://www.omim.org/）数据库中进行检索，将条件设置为相关分数（Relevance Score）≥5 进行筛选，在 Uniprot 数据库（https://www.uniprot.org/）中查找到相应的标准化疾病靶点。

1.3 药物与KOA 的交集靶点筛选及蛋白互作网络构建 应用R 软件分析出药物活性成分作用靶点与KOA 疾病靶点的交集，并以韦恩图的方式呈现。将交集靶点导入STRING 数据库（https://string-db.org/），蛋白种类的条件设置为“Homo Sapiens”，设置最低蛋白间互动分数的条件为0.7，构建药物活性成分-KOA 交集靶点蛋白互作网络（Protein-Protein Interaction,PPI），可得到 PPI 网络图，并基于 R 软件计算出获得交集靶点出现的频次。

1.4 药物-成分-KOA 靶点网络构建 将筛选出的靶点导入Cytoscape 3.7.1 软件，制作出药物-活性成分-KOA 靶点网络图。图中每个节点代表不同的有效成分或共同作用靶点，每条连线代表网络中节点的相互关系。

1.5 Gene Ontology 富集分析和 KEGG Pathway 富集分析 在 Bioconductor 数据库（http://www.bioconductor.org/）中下载相关数据，应用R 软件对药物与疾病共同作用靶点进行Gene Ontology（GO）富集分析和KEGG Pathway 富集分析，应用Perl 插件对部分结果进行转化。

1.6 分子对接 从PDB 数据库中查找并下载核心靶点蛋白的3D 结构，应用相应软件对靶点及活性成分进行处理，然而导入AutoDockTools 中进行分子对接，药物分子与靶点的结合能≤-5.0 kJ/mol 则被认为具有较好的结合活性。

2 结果

2.1 药物有效成分与作用靶点 通过TCMSP 数据库检索得到独活药物活性成分99 种，筛选后得到9种有效成分。桑寄生药物活性成分46 种，筛选后得到2 种有效成分。独活活性成分作用靶点151个，桑寄生活性成分作用靶点93个。应用Perl 插件筛选并剔除重复部分得到独活与桑寄生有效成分作用靶点151个。其中编号为MOL004782 的分子尚未发现作用靶点。“独活-桑寄生”药物有效成分与靶点数见表1。

表1 独活-桑寄生药物有效成分与靶点数

2.2 KOA 作用靶点筛选 以“Knee Osteoarthritis”为关键词，相关性分数≥5 为筛选条件，在GeneCards 和OMIM 数据库中查找到KOA 的疾病靶点共为2 261个。

2.3 药物-活性成分-KOA 交集靶点互作网络 应用R 软件对比2 261个KOA 靶点与151个药物有效成分作用靶点，筛选出94个共同作用靶点并画出韦恩图，得到的韦恩图见图1。采用Cytoscape 3.7.1软件构建可视网络图，在药物-有效成分-KOA 交集靶点互作网络图中，共获得96个节点和134 条边。见图2。药对中各活性成分与KOA 疾病交集靶点的Degree 值见表2。

图1 独活-桑寄生活性成分靶点与KOA 疾病靶点韦恩图

图2 药物-有效成分-KOA 交集靶点互作网络

表2 药物活性成分与KOA 交集靶点的Degree 值

2.4 PPI 网络图 在STRING 数据库输入94个共同靶点，构建PPI 网络图。见图3。筛选出核心靶点，其中出现频次较高的有 TNF、ILB、AKT1、TP53、MMP9、CASP3 等。见图 4。

图3 药物-疾病交集靶点蛋白互作（PPI）图

图4 药物-疾病交集靶点Degree 柱状图

2.5 GO 富集分析与KEGG 富集分析 对共同作用靶点进行分子功能GO 富集分析，共得到2 064 条生物学功能条目，42 条细胞组成条目和122 条分子功能条目，各组分排名前10 的条目见图5。对共同作用靶点进行KEGG 生物途径富集分析，总共有148个不同生物途径，排名前30 的生物途径见图6。其中排名前5 的包括：脂质与粥样硬化、糖尿病并发症中AGE-RAGE 信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、白细胞介素-17 信号通路和肿瘤坏死因子信号通路。“独活-桑寄生”干预KOA 的主要信号通路见图7。

图5 共同靶点GO 功能分析气泡图

图6 KEGG 富集分析气泡图

图7 “独活-桑寄生”干预KOA 的主要信号通路

2.6 分子对接 将筛选到的核心靶点和“独活-桑寄生”药对中核心成分进行分子对接，结果表明该药对的核心成分槲皮素可对核心靶点TNF、ILB 和AKT1 起作用，从而间接证实该药对可通过调节TNF、ILB 和AKT1 靶点对KOA 起治疗作用。见图8。

图8 “独活-桑寄生”药对核心靶点与KOA 的分子对接

3 讨论

KOA 在中医学中归属于“骨痹病”范畴。其发病通常与风寒湿邪侵袭、人体肝肾亏虚、瘀血阻络有关。《素问·痹论篇》云：“风寒湿三气杂至，合而为痹……骨痹不已，复感于邪，内舍于肾。”同时《素问·上古天真论》中曰：“七八肝气衰，筋不能动。八八天癸竭，精少，肾脏衰，形体皆极。”可见，随着年龄增加，肝肾亏虚，正体不足，邪毒就容易侵袭人体，从而发生痹病。《张氏医通》：“膝者筋之府，膝痛无不因肝肾亏虚者，虚则风寒湿气袭之。”《证治准绳》亦云：“膝痛有风，有寒，有闪挫，有瘀血，有痰积，皆实也，肾虚其本也”，肝肾亏虚是KOA 发生的主要内因，风寒湿邪侵袭人体为外因。同时，也有一些医家认为瘀血也是影响痹病的发病因素之一，《类证治裁·痹证》曰：“痹久必有瘀血”，《杂病源流犀烛》指出“痹者，闭也。三气杂至，壅敝经络，血气不行，不能随时祛散，故久而为痹。”王清任在《医林改错》中也提出“痹有瘀血”。由此可见本病肝肾亏虚是基础，气血瘀滞是关键，兼夹外感邪气，属于本虚标实证，治疗当以补肾活血为主，辅以祛风散寒除湿[18]。

独活归属肾、膀胱经，祛风除湿、宣痹止痛；桑寄生归属肝、肾经，补益肝肾、强筋壮骨。“独活-桑寄生”常配伍用于补益肝肾、祛风除湿，是经典方独活寄生汤中的药对。在KOA 治疗的中药用药规律分析中发现，这两味药在治疗KOA 的临床组方中应用较为广泛。现代药理学研究表明独活乙醇提取物能够抑制环氧化酶-1 及环氧化酶-2，具有良好的抗炎、镇痛效果[19]。桑寄生具有祛风湿、补肝肾、强筋骨的作用，其祛风湿的作用可能与免疫抑制有关[20]。本研究基于网络药理学技术对“独活-桑寄生”药对干预KOA 的作用机制作了初步的数据挖掘。研究结果显示“独活-桑寄生”有效成分11 种，药物有效成分已知的作用靶点151个，其中干预KOA 的潜在靶点 94个。最受关注的是槲皮素（quercetin，MOL000098），作用靶点多达 148个，其中与 KOA 相关的靶点多达88个。研究表明，槲皮素是一类双黄酮类化合物，具有多种药理作用，包括抗氧化、神经保护、抗病毒、抗癌、抗菌、抗炎、保肝、抗肥胖等[21～22]。在OA 的发展过程中，槲皮素能降低TNF-α、MMP3、MMP9、CCL2 的表达，在抗炎的同时抑制软骨细胞外基质的降解[23]。汤喜兰等[24]研究发现槲皮素对TNF-α、IL-6、IL-1β 的负性调节作用可能是通过抑制NF-κB 信号通路的激活完成。可见，槲皮素可能是“独活-桑寄生”作用于KOA 的关键活性成分之一。同时，β-谷甾醇和谷甾醇也具有抗炎、抗氧化等作用，其对KOA 的治疗作用也屡见报道。

“独活-桑寄生”与KOA 共同作用靶点PPI 映射及分析得到出现频次较多的靶点，如TNF、ILB、AKT1、TP53、MMP9、CASP3 等，这些可能是“独活 -桑寄生”治疗KOA 的潜在作用靶点。TNF 是一种常见的炎性细胞因子，在KOA 发病中有重要作用，中老年患者KOA 越严重则关节液中TNF-α 的含量水平越高[25]，通过降低关节中TNF-α 的含量能减轻关节炎症，保护关节软骨，从而延缓KOA 的病情进展[26]。同时，IL-1β 属于白细胞介素分子家族，主要与炎症反应有关，下调IL-1β 表达能有效抑制相关炎症反应[27～28]。MMP9 属于金属基质蛋白酶家族，主导软骨细胞外基质的降解，常常与IL6、TNF-α 等致炎因子协同促进关节软骨的破坏[29]。此外，AKT1 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，研究显示AKT1 与细胞凋亡有关，抑制AKT1 的表达能促进软骨细胞的凋亡[30～31]。

GO 富集分析与KEGG 富集分析结果显示，上述共同作用靶点参与的生物活动主要涉及对脂多糖的反应、氧化应激反应及对细菌源性分子的反应等，并大多富集于脂质与粥样硬化、糖尿病并发症中AGE-RAGE 信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、白细胞介素-17 信号通路和肿瘤坏死因子信号通路。 晚期糖基化终末产物（Advanced Glycosylation End Products, AGE） 及 其 受 体（Receptor of AGE,RAGE）的作用机制尚未完全明确。目前研究显示AGE 主要在糖尿病患者体内高表达[32]，AGE-RAGE 能激活下游 NF-κB 信号通路，促进 IL-6、IL-8、TNF-α 等致炎因子的表达，激活的NF-κB 又能增加RAGE 的表达，形成正向的反馈调节[33]。除此之外，AGE-RAGE 还与 VEGF 的表达正相关，阻断AGE-RAGE 的激活能抑制VEGF 的表达[34]。目前关于AGE-RAGE 信号通路的研究主要集中在糖尿病及心血管疾病方面，涉及OA 的研究较少。本研究KEGG 富集结果提示“独活-桑寄生”干预KOA 的作用靶点与AGE-RAGE 信号通路高度相关，这为研究KOA 的发病机制提供了新的思路。而IL-17 和TNF 信号通路与KOA 的发病及病情进展密切相关，分子对接结果发现，“独活-桑寄生”药对中槲皮素能调节 ILB、TNF 和 AKT1 对 KOA 起治疗作用，间接证实了该药对具有调节ILB、TNF 和AKT1 靶点治疗KOA 的潜在作用，但该分子机制仍需实验进一步验证。

综上所述，“独活-桑寄生”中11个有效成分，调控 IL6、TNF、AKT1 等 94个靶点，主要通过AGE-RAGE、TNF 和ILB 等信号通路干预KOA。本研究采用中药药理学分析，预测出“独活-桑寄生”药对治疗KOA 的潜在作用机制，为进一步研究该药治疗KOA 的分子机制提供依据。同时，有利于进一步明确中药复杂成分的主要活性成分及作用机理，为该药对在KOA 的临床治疗中应用提供证据。