酶法降解奶垢工艺研究

2022-06-30林智伟常甜甜周英

中国乳品工业 2022年6期

林智伟，常甜甜，周英

（华东理工大学生物工程学院，上海200237）

0 引言

在乳制品的生产和加工中，超高温瞬时灭菌（UHT）等超高温设备及管壁不可避免地残留部分乳制品。残留的乳制品以蛋白质、脂肪、无机盐和糖类等成分在设备上沉积结垢[1]。乳制品是微生物的良好养分，结垢污染物将导致细菌沉积并成为微生物滋生地[2]，影响牛奶及其他乳制品的质量安全[3]。为避免食物性疾病发生[4]，乳制品生产设备的卫生情况尤其重要。

传统的乳制品污垢清洗工艺选择常规的化学原料作为主要清洁成分。酸碱清洗剂的价格低廉且操作简便，但存在许多缺陷[5]。烧碱使用不当会灼伤操作人员，与水溶液里的Ca2+、Mg2+容易产生沉淀，在管道内形成水垢增加清洗难度，并且会腐蚀设备中的橡胶类零件，减少使用寿命[6]。磷酸和硝酸使用频率较高、清洗效果较好，但易残留，加热条件下的PO43-破坏牛乳的钙盐平衡产生白色沉淀。硝酸易挥发形成腐蚀性酸雾。次氯酸钠等氯化物具有良好的杀菌和消毒效果，但次氯酸钠中的Cl-会点蚀不锈钢设备，长时间使用甚至发生管道穿孔。如今的洗涤剂行业面临清洗排放后的工业用水变成破坏环境的高酸碱度废水及传统单一成分的清洁剂不能达到祛污需求等问题[7]。而在清洁剂中加入酶制剂等新工艺的发展，极大改善了清洁剂的除污力和清洁效能[8]。生物酶具有高效催化率，添加到清洗剂中可以增强不同污迹的祛污性[9]，还能提高环境安全性[10]。如今微生物产酶已实现工业化，大量的研究也改善了酶制剂的耐碱、耐热性能，加酶洗涤剂的安全性也得到证明。

本研究在酪蛋白和乳清蛋白（WPC）模型流体的基础上[11-17]，加入模拟牛奶滤液（SMUF）[18]制备模拟奶垢代替超高温设备管道中的奶垢，解决工厂管道奶垢性质不稳定，不同生产批次成分差异明显的问题。通过酶制剂和碱性盐及NaOH溶液进行不同方式的复配，使用紫外光谱监测奶垢中蛋白质的降解效果[16]。探究在适宜的条件下，用可生物降解的酶制剂替代部分酸碱洗涤剂是有效且经济可行的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

氢氧化钠、酪蛋白、酪氨酸、四硼酸钠、碳酸钾、磷酸氢二钠购自上海泰坦科技股份有限公司；三氯乙酸购自国药集团化学试剂有限公司；磷酸二氢钾购自永华化学科技（江苏）有限公司；一水柠檬酸甲购自大连美仑生物技术有限公司；二水柠檬酸钠、硫酸钾、氯化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、乳糖购自上海凌峰化学试剂有限公司；二水氯化钙购自北京索莱宝科技有限公司；六水氯化镁购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；食品级酪蛋白、乳清蛋白购自河南誉州生物科技有限公司；氢氧化钠溶液购自上海柯灵展新化工有限公司；碱性蛋白酶、脂肪酶、糖化酶，市售。

1.1.2 仪器与设备

FiveEasy Plus台式pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)；HH-WO油浴锅，河南予华；Synergy Mx酶标仪，美国伯腾；TA-XT2i质构仪，英国Stable Micro System；ZQLY-180N振荡器，上海知楚；RR400Q101超纯水制备系统，默克（上海）。

1.2 方法

1.2.1 模拟奶垢的制备

超滤液（SMUF）的配制调整如下:11.61 mmol/L KH2PO4、3.70 mmol/L K3C6H5O7·H2O、6.09 mmol/L Na3C6H5O7·2H2O、1.03 mmol/L K2SO4、2.17 mmol/L K2CO3、8.05 mmol/L KCl、8.98 mmol/L CaCl2·2H2O、3.21 mmol/L MgCl2·6H2O、24.0 g乳糖搅拌溶解并定容至480 mL。按照表1制备不同蛋白比例的模拟奶垢,置油浴锅中于130℃加热2 h，冷却至室温后于4℃冰箱保存使用。

表1 制备模拟奶垢配料表

1.2.2 模拟奶垢的质构测定

奶垢切成重量和形状相近的长方体。质构仪的检测前后速度为1 mm/s，压缩程度为25%，探头选择P36。

1.2.3 碱性蛋白酶的活力测定

参照GB/T 23527-2009法，调整反应体积且将酶标仪作为检测仪器。酪蛋白溶液使用前在40℃水浴锅中预热5 min。分别取1.0 mL酶液在适宜温度中预热2 min，空白组加入2.0 mL三氯乙酸，实验组加入1.0 mL酪蛋白溶液。摇匀且在40℃水浴锅中反应10 min后，空白组加入1.0 mL酪蛋白溶液，实验组加入2.0 mL三氯乙酸，充分摇匀后静置5 min，过滤。分别取1 mL滤液在275 nm波长下测定其吸光度。

1.2.4 模拟奶垢降解的测定

采用紫外光谱275 nm（蛋白质常用光谱250～320 nm范围内的吸光度测量可准确方便地测定溶液中蛋白质浓度）和细菌浓度600 nm分别表示溶液中被降解的蛋白质浓度和上清液浑浊度。设NaOH溶液的降解效果为100%。

1.2.5 酶制剂与NaOH溶液的测定

根据工厂的管道清洁环境和实际情况[19-20]，设置温度60℃，转速75 r/min，时间40～60 min的恒温摇床模拟管道清洗条件。NaOH溶液的浓度均为1.5%[21]。

（1）碱性蛋白酶与NaOH溶液混合降解。对照组为NaOH溶液，实验组为NaOH溶液和碱性蛋白酶AKP-2不同方式的混合复配。碱性蛋白酶溶液酶活单位为200 U/mL。

（2）不同种类的酶制剂与NaOH溶液混合降解。对照组为NaOH溶液，实验组为NaOH溶液和多种酶制剂以不同比例的混合复配。酶制剂溶液酶活单位为200 U/mL。

（3）碱性蛋白酶与碱性盐溶液混合降解。对照组为NaOH溶液，实验组分别为加入NaOH调整pH至10.5（碱性蛋白酶酶活最适pH）的NaHCO3和碱性蛋白酶AKP-2混合溶液以及Na2CO3和碱性蛋白酶AKP-2混合溶液。碱性蛋白酶溶液酶活单位为100 U/mL。

2 结果与讨论

2.1 模拟奶垢的外观和质构分析

如图1所示，根据市售奶制品常见的3种蛋白比例制备的模拟奶垢，外观颜色无明显差异，主要呈现黄褐色海绵状，与乳品厂中超过110℃形成的灰黄色奶垢外观相近。这两种蛋白性质不同，酪蛋白可支撑结构；乳清蛋白热稳定差，易受高温影响，因此酪蛋白和乳清蛋白影响奶垢的硬度和黏性[22-23]。

图1 不同蛋白比例的奶垢外观

由表2可知，酪蛋白比例越大，模拟奶垢硬度越大。其中两种蛋白比例为8∶2制备的奶垢的硬度最大。UHT等超高温乳制品生产加工设备产生的奶垢比实验室环境中制备的模拟奶垢所需条件更加复杂，以硬度指标作为首要考虑因素，后续采取酪蛋白和乳清蛋白为8∶2的比例制备模拟奶垢。

表2 不同蛋白比例奶垢的质构测定结果

2.2 碱性蛋白酶的筛选

不同蛋白酶的酶活通常测定条件不同，需要在相同条件下筛选出酶活性高，热稳定性好的碱性蛋白酶。如图2所示，4种碱性蛋白酶在60℃的酶活测定，前3种酶制剂的活性较高，均超过1.8×105U/g，属于耐高温高碱酶制剂，AKP-4的酶活性低于5.0×103U/g。如图3所示，碱性蛋白酶AKP-1、AKP-2、AKP-3在60℃，40 min内分别保留了83%、95%和93%的残留活性。

图2 碱性蛋白酶的酶活

图3 碱性蛋白酶的热稳定性

2.3 酶制剂与NaOH溶液的复配降解

商用清洁剂常含有表面活性剂、助剂及酶制剂等成分[24]。国外学者认为酶制剂和NaOH溶液共同作用，可将乳制品污染的膜恢复其渗透性[25]。

2.3.1 碱性蛋白酶和NaOH溶液混合降解

图4和图5显示碱性蛋白酶AKP-2和NaOH溶液混合复配降解奶垢的效果。最高降解率可达到NaOH溶液降解效果的93%（OD275）和95%（OD600）。NaOH溶液单独作用越久，奶垢的降解效果越好。碱性蛋白酶和NaOH溶液混合，导致蛋白酶在碱性环境中变性失活，部分NaOH溶液无法参与降解过程。一旦混合越久，不恰当的复配方式将弱化NaOH溶液和碱性蛋白酶的共同作用。虽然合理的复配方式可以降解奶垢，但部分复配方式中蛋白酶的活性受到NaOH溶液影响，降低了酶的利用率。

图4 降解模拟奶垢的效率OD275

图5 降解模拟奶垢的效率OD600

2.3.2 不同种类的酶制剂与NaOH溶液混合降解

由图6和图7可知，不同复配方式均达到不同的降解效果。最高降解率可达到NaOH溶液降解效果的92%（OD275）和93%（OD600）。模拟奶垢的主要成分是酪蛋白和乳清蛋白，碱性蛋白酶在蛋白降解中起到重要作用。但是酶制剂本质属于蛋白，蛋白酶抑制其它酶制剂的活性，降低利用效率。未来考虑改变蛋白酶在洗涤剂中的情况，可为复合洗涤剂的开发提供更多思路。

图6 降解模拟奶垢的效率OD275

图7 降解模拟奶垢的效率OD600

2.3.3 碱性蛋白酶和碱性盐混合降解

Na2CO3和NaHCO3对环境污染少且腐蚀性弱。NaHCO3溶液常用于清洗医疗器械中的脂肪蛋白等混合污垢，含水Na2CO3溶液在高温下能清洗油污。添加Na2CO3和NaHCO3溶液可减少NaOH溶液使用量，从而提高碱性蛋白酶的利用率。

结果如图8和图9所示，NaHCO3和碱性蛋白酶AKP-2的复配降解效果仅达到NaOH溶液降解效果的59%（OD275）和65%（OD600），平均降解率为62%。NaHCO3通过软化奶垢，减少其与设备的附着达到清洗效果，而NaOH溶液直接将奶垢中的蛋白质分子分解成小分子。在工厂设备中，奶垢与设备的黏着性越低越容易被清洗，虽然降解效果有待提高，但作为碱性助剂的NaHCO3溶液，在奶垢清洗剂的开发中十分具有前景。

图8 降解模拟奶垢的效率OD275

图9 降解模拟奶垢的效率OD600

Na2CO3洗剂常用于清除油脂和矿物盐等。硬水中的矿物盐和杂质在壁上形成难溶解物质而产生水垢，通过Na2CO3可以去除。Na2CO3和油脂反应后生成可溶于水的脂肪酸盐。结果如图10和图11所示，Na2CO3和碱性蛋白酶AKP-2的复配降解效果达到纯NaOH降解效果的69%（OD275）和79%（OD600），平均降解率为74%。CO32-比HCO3-更易水解，碱性更强，所以降解效果更好。