牵拉损伤对蛙坐骨神经干动作电位影响的定量研究

陈钰涵，陈 穗，罗 勇，王水金，郭佳铭，林柏先，刘 静，2

（1．汕头大学医学院机能学实验室，广东 汕头 515041；2．汕头大学医学院生理学教研室，广东 汕头 515041）

周围神经损伤是临床上常见的一类疾病，若未能及时有效地接受神经修复和康复治疗，患者的感觉和运动功能将会受损，甚至丧失工作和生活能力[1]。而牵拉损伤是一种特殊的周围神经急性损伤类型，严重的牵拉损伤可引起失神经支配导致不可逆的功能障碍[2]。某些手术容易引起神经牵拉损伤，如甲状腺腺叶切除术、腰椎间盘切除术等[3-4]。此外，牵拉伸长神经在一些手术操作中必不可少，如神经延长术和肢体延长术等[5-6]。因此，神经牵拉损伤也是这类手术的重要并发症，若外科手术中牵拉使神经张力过大将导致神经损伤，从而影响神经的修复与功能，而预防神经牵拉损伤的关键在于明确神经能够耐受牵拉的程度。本研究使用牛蛙坐骨神经作为研究对象，建立简便、可量化的神经牵拉损伤模型，探究牵拉对蛙坐骨神经动作电位的影响及坐骨神经能够耐受的牵拉程度，为临床手术中神经牵拉损伤的研究提供动物模型的参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

牛蛙60只，年龄、雌雄不限，健康，体质量约200 g，由汕头大学医学院机能学实验室提供。

1.2 主要仪器和试剂

常用蛙类手术器械、经典神经干屏蔽盒、BL-420F生物机能实验系统（成都泰盟软件有限公司）、艾德堡HP-5N推拉力计及HLA螺旋机架（乐清市艾德堡仪器有限公司）、任氏液（自配）。

1.3 蛙坐骨神经干牵拉装置

HP-5N推拉力计固定于配套的HLA螺旋机架上，转动螺旋机架的转盘可使推拉力计匀速上升或下降。在推拉力计下方的小铁钩加套一条小塑胶管（图1），使钩子牵拉神经干的接触面积增大，同时避免金属对神经干的影响。牛蛙毁髓后剪开大腿部皮肤，用玻璃分针沿坐骨神经沟游离出坐骨神经。用蛙足钉穿过蛙的髋关节和膝关节，避开坐骨神经，将蛙固定在蛙板上，置于推拉力计下方。推拉力计调零后，使其钩子勾住坐骨神经干的中段，转动转盘，缓慢匀速地向上牵拉神经干。当推拉力计显示拉力到达目标拉力值后，维持拉力不变持续30 s。实验过程中在神经干表面滴加任氏液保持湿润。

图1 蛙坐骨神经干牵拉实验装置示意图

1.4 蛙坐骨神经干动作电位相关指标的测量

牵拉后的坐骨神经干两端结扎后剪断，离体，长度约6～7 cm，在任氏液中浸泡10 min后，置于神经干屏蔽盒中且使神经干头端位于刺激输出电极一侧，尾端位于记录电极一侧（图2）。盖上屏蔽盒盖子，开始运行系统模块：（1）最适刺激强度，程控单刺激，波宽0.05 ms，延时5 ms，采样率50 kHz，刺激强度从0开始，增量为0.02 V；（2）不应期，起始波间隔8 ms，减量为0.2 ms，刺激时间间隔2 s，刺激强度2 V；（3）双电极法测神经干动作电位传导速度，刺激强度2 V，见图3。

图3 蛙坐骨神经干动作电位相关指标的测量

1.5 牵拉处理分组

将60只牛蛙的120根坐骨神经随机分为12组，每组10根，区分左右。其中一组为对照组，将神经干离体后在任氏液中浸泡10.5 min，之后测量相关指标。其余为实验组，各组体神经干分别以0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 N的拉力牵拉30 s，之后将神经干离体，于任氏液中浸泡10 min后测量相关指标。根据需要加做0.1、0.2、0.3 N组。

1.6 统计学分析

将BL-420F生物机能实验系统的数据导出，整理出各组标本的动作电位幅度、绝对不应期、神经干传导速度。采用SPSS 20.0软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett-t检验，不符合正态分布的数据以[M（Q1，Q3）]表示，多组间比较采用Kruskal-WallisH检验，组间两两比较采用Bonferroni检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同牵拉力对蛙坐骨神经干完整性及活性的影响

牵拉力＜2.8 N时，神经干未断裂。牵拉力为2.8 N时，有2条神经干引导出的动作电位幅度为0 mV，其余神经干可引导出一定幅度的双相动作电位。而牵拉力为3.2 N时，该组所有神经干均断裂。

2.2 不同牵拉力对蛙坐骨神经干动作电位波形的影响

选择各组中有代表性（各项指标接近平均值）的动作电位波形进行比较。牵拉力不超过2.8 N时，随着刺激强度增大，动作电位波形表现为幅度降低、波宽增大、波峰与刺激起点的时间间隔增大；牵拉力达到3.2 N时，无动作电位产生。见图4。

图4 不同牵拉力作用对蛙坐骨神经干动作电位波形的影响

2.3 不同牵拉力对蛙坐骨神经干动作电位各项指标的影响

采用0～0.4 N的牵拉力处理蛙坐骨神经干，发现动作电位的传导速度显著下降，差异具有统计学意义（P值均＜0.05），见表1。进一步加大牵拉力，结果发现除了2.8 N处理组，其他组动作电位的刺激阈值与对照组相比差异无统计学意义（P值均＞0.05）；对于绝对不应期，2.4、2.8 N处理组与对照组相比差异有统计学意义（P值均＜0.05）；而动作电位幅度及传导速度均随着牵拉力的增大而逐渐减少（P值均＜0.05）。见图5。

表1 不同牵拉力对蛙坐骨神经干传导速度的影响

图5 不同牵拉力对蛙坐骨神经干动作电位的影响

3 讨论

周围神经牵拉损伤是临床常见的疾病，严重的神经牵拉损伤可导致不可逆的感觉及运动功能障碍。对周围神经牵拉损伤进行定量研究将有助于明确神经可耐受的牵拉程度。本研究中，0.4 N的牵拉力对神经干的动作电位幅度未产生显著影响，0.8 N以上的牵拉力才能降低神经干的动作电位幅度，而0.1 N的牵拉力则足以使神经干的动作电位传导速度降低，这表明与动作电位幅度相比，传导速度的变化对牵拉损伤更为敏感。因此，推测0.1～0.4 N的牵拉力与≥0.8 N的牵拉力造成神经损伤的机制不同。

根据神经结构受损情况，Sunderland将神经损伤分为5个级别。Ⅰ级：髓鞘中断，轴突连续性完好；Ⅱ级：轴突及其髓鞘失去连续性，神经的各种结缔组织即神经内膜、神经外膜和神经束膜得以保留；Ⅲ级：轴突和神经内膜受损，但神经束膜未受损；Ⅳ级：轴突、神经内膜和神经束膜受损，但神经外膜保留；Ⅴ级：神经断裂[7-8]。可见，髓鞘是神经最早、最易损伤的结构。脊椎动物神经产生的动作电位依赖郎飞结进行快速的跳跃性传导，而髓鞘化的轴突是形成郎飞结的结构基础[9]，髓鞘损伤将导致神经传导速度降低[10]。因此，本研究中0.1～0.4 N的牵拉力对神经干造成的损伤可能属于Sunderland Ⅰ级，仅造成了神经干内轴突髓鞘损伤或中断从而引起传导速度减慢，而轴突的连续性保留使动作电位得以正常产生。0.8 N以上的牵拉力造成的神经损伤可能属于Sunderland Ⅱ级，由于轴突的断裂，部分神经纤维在刺激电极处产生的动作电位无法传导至接收电极，使神经干动作电位幅度降低。3.2 N的牵拉力使神经干完全断裂，属于Sunderland Ⅴ级损伤。

0.4～2.0 N的牵拉力对绝对不应期没有明显影响，而2.4 N的牵拉力则引起绝对不应期的明显延长。与此类似的是刺激阈值，2.8 N的牵拉力才足以引起刺激阈值的增大。且绝对不应期与刺激阈值随牵拉力变化的曲线非常相似。绝对不应期是神经细胞在发生一次兴奋后细胞膜钠通道失活的时期，之后钠通道开始复活[11]。刺激阈值主要与细胞膜中钠通道的密度和功能状态以及细胞外的钙离子浓度有关。本实验中绝对不应期和刺激阈值在牵拉力较大时也无明显变化，原因可能是牵拉后部分未断裂轴突的离子通道的密度和功能仍正常，动作电位在这些“幸存”的轴突中能正常产生并被接受电极记录。本研究的不足之处在于未能在细胞水平观察不同程度牵拉力造成的神经损伤病理变化，对神经损伤的量化局限于神经功能水平，对损伤引起的神经结构的改变仍有待进一步研究。

目前国内外对周围神经损伤的研究多为探讨其损伤后的病理学改变或修复机制，且绝大多数所用的模型为大鼠或家兔。用无齿输精管分离钳在体牵拉大鼠或家兔的坐骨神经至神经延长1倍长度并持续30 s[12-14]，使用高精度测力计以0.2 N的拉力在体牵拉大鼠的海绵体神经[15]。上述牵拉神经干的方法多为一次性的牵拉，不能用于定量研究牵拉程度对神经的损伤情况。

本研究利用定量研究的方法探讨了牵拉力对蛙坐骨神经干的损伤程度。蛙坐骨神经干在2.8 N以下的牵拉力作用下可保持形态完整，3.2 N牵拉力则可使神经干发生断裂。蛙坐骨神经干动作电位的不同指标对牵拉损伤的耐受程度不同，传导速度对牵拉损伤最敏感，0.1 N的牵拉力即可降低传导速度。当牵拉力达到0.8 N时，动作电位幅度才开始降低。这可能是因为0.1～0.4 N的牵拉力只造成神经髓鞘损伤而引起传导速度的减慢，0.8 N以上的牵拉力则可造成神经干内轴索断裂而降低复合动作电位幅度。刺激阈值和绝对不应期则对牵拉损伤的耐受程度较高。本研究的蛙坐骨神经牵拉损伤模型量化了牵拉力对坐骨神经动作电位相关指标的影响。