HBV 相关DLBCL 患者的病理学特点及AID 表达差异及与预后关系的多因素分析

杨青华，耿东方，李小亚，李印平

（濮阳市安阳地区医院1.医学检验科；2.感染性疾病科；3.病理科，河南 安阳 455000）

病毒感染可使恶性肿瘤的发生风险明显增加， 其中恶性肿瘤中增长最快的肿瘤之一是非霍奇金淋巴瘤， 以弥漫性大B 细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma ，DLBCL）最为常见，其在组织形态、遗传特征、免疫表型、临床表现对化疗的反应和预后方面高度异质[1]。乙肝病毒（Hepatitis B virus ，HBV）感染是全球性的公共卫生问题，DLBCL 中的HBV 感染率高于普通人群，并且患者预后较差[2]。 然而，在DLBCL 发生和发展过程中HBV的病因机制仍不清楚。 活化诱导胞嘧啶脱氨酶（activation induced cytosine deaminase ，AID） 是一种DNA / RNA 编辑酶， 主要诱导胞嘧啶脱氨酶变成尿嘧啶以参与体细胞生发中心B 细胞免疫球蛋白基因的超突变 （somatic hypermutation ，SHM）和抗体的类别转换重组 （class．switch recombination CSR）过程[3-4]。SHM 和CSR 的异常出现导致目标基因突变和染色体易位， 这在大多数B 细胞淋巴瘤的发生中起重要作用[5]，因此，AID 在DLBCL 的发病机理中起重要作用。为了探讨HBV 相关DLBCL患者病理学特点及AID 表达差异及与预后关系的多因素分析，本研究选取2018年1月至2020年3月在我院治疗的DLBCL 患者110 例进行研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年1月至2020年3月在我院治疗的DLBCL 患者110 例， 其中男性60例，女性50 例；年龄18～71 岁，＜50 岁62 例，≥50岁48 例。 入选标准：（1）诊断符合WHO 制定的淋巴造血系统肿瘤分类标准；（2） 有乙肝五项检查；（3）接受CHOP 方案或RCHOP 化疗方案；（4）临床随访资料保存完整。 排除标准：（1）合并有其他病毒性肝炎、HIV 感染；（2） 合并其他系统恶性肿瘤；（3）有心、肝、肾等重要脏器疾病。

1.2 实验室检查 免疫组化法检测AID 表达:手术切除的标本组织经10%甲醛固定24～48 h， 之后行石蜡包埋。将石蜡标本切成厚度约为4 mm 的连续组织切片4 张， 60℃烘烤3 h，常规脱蜡，加3%H2O2在室温下孵育10 min，PBS 洗涤3 次， 每次3 min，柠檬酸溶液修复，PBS 洗涤3 次，每次3 min，加上一抗(抗AID)孵育过夜，PBS 洗涤，添加聚合物增强剂，在室温下孵育20 min，PBS 洗涤，添加酶标记的抗小鼠聚合物 （二抗）， 在室温下孵育30 min 用PBS 洗涤3 次，每次3 min，DAB 显色，用水冲洗，用苏木精复染，常规脱水封片。

AID 抗体购自美国Abcam 公司(ab59361)；DAB 显色试剂盒、EDTA 修复液、柠檬酸盐修复液、PBS 缓冲液均购自北京中杉金桥公司。

1.3 统计学处理 数据统计采用SPSS 22.0 软件，AID 表达、 性别等资料采用频数或百分比表示，组间比较使用χ2检验； 生存分析采用Kaplan-Meier法； 采用Cox 回归分析预后因素。 检验水准α 为0.05。

2 结果

2.1 伴和不伴HBsAg 感染患者临床病理特征比较伴HBsAg 感染患者年龄＜50 岁、 临床分期Ⅲ～Ⅳ、ALT＞40 U/L、AST＞40 U/L、脾脏受累的比例明显高于不伴HbsAg 感染患者（P＜0.05）；伴和不伴HBsAg 感染患者性别、结节外受累区域、肝脏受累、IPI评分、ECOG 评分和治疗方案比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表1。

表1 伴和不伴HBsAg 感染患者临床病理特征比较

2.2 伴和不伴HBsAg 感染患者AID 表达情况 伴HBsAg 感染患者AID 阳性表达率明显高于不伴HBsAg 感染患者（P＜0.05），见表2；AID 蛋白主要表达于细胞质，呈棕褐色，见图1。

表2 伴和不伴HBsAg 感染患者AID 表达情况

图1 免疫组化染色图

2.3 HBsAg、AID 表达与患者预后关系 HBsAg（+）和AID（+）患者中位生存时间为23 个月（95%CI：21.68～24.32），明显少于HBsAg（+）和AID（-）、HBsAg（-）和AID（+）、HBsAg（-）和AID（-）患者的35个月 （95%CI：32.95 ～37.05）、36 个月 （95%CI：33.10～37.75）和35 个月（95%CI：32.35～37.65）（ χ2=8.294、41.769 和14.626，P＜0.05）。

HBsAg（+）和AID（-）、HBsAg（-）和AID（+）、HBsAg（-）和AID（-）患者中位生存时间比较差异无统计学意义（ χ2=1.921、0.822 和1.022，P＞0.05），见图2。

图2 生存曲线图

2.4 多因素分析 Cox 比例风险回归分析结果显示：HbsAg 和AID 双阳性、 临床分期和IPI 评分是DLBCL 患者预后的影响因素（HR=2.101、1.882 和2.011，P＜0.05），见表3。

表3 Cox 比例风险回归分析结果

3 讨论

淋巴瘤是淋巴造血系统肿瘤， 目前认为其发生与病毒感染、自身免疫状态和环境因素有关[6-7]。近年来，DLBCL 发生与病毒感染之间的关系越来越受到关注， 特别是合并有HBV 感染的DLBCL患者的临床预后比单纯DLBCL 患者差[8-10]。淋巴瘤患者的免疫功能异常，导致HBV 感染的概率明显高于健康人[11]。 HBV 分布较广，研究HBV 感染与DLBCL 之间的关系具有重要意义。

本研究结果显示，伴HBsAg 感染患者年龄＜50岁、 临床分期Ⅲ～Ⅳ、ALT＞40 U/L、AST＞40 U/L、脾脏受累的比例明显高于不伴HbsAg 感染患者。结果表明与阴性组相比，HBsAg 阳性组发病年龄小、临床分期晚、脾脏侵袭频率高，其他研究[12-14]也有类似的结果。HBV 具有肝细胞吞噬作用，是肝癌最重要的危险因素， 同时也具有淋巴细胞吞噬作用并引起淋巴系统感染， 一旦发生慢性HBV 感染，长期的抗原刺激而导致DLBCL 的发生有其生物学合理性。 因此，HBV 感染可能是DLBCL 发病机理中的重要危险因素之一[15]。

AID 在生发中心表达。 在正常情况下，免疫球蛋白基因的体细胞SHM 和CSR 促进抗体亲和力成熟和B 细胞表面受体亚型的改变， 导致体细胞异常突变或基因结构改变，最终发展为肿瘤[16-17]。AID 在滤泡性淋巴瘤、黏膜相关性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、 弥漫性大B 细胞淋巴瘤等多种B 细胞肿瘤中表达[18]。AID 导致B 细胞淋巴瘤的机制可能与病原体或发炎性因子通过核转录因子KB 信号通路的活化而导致AID 的上调有关[19]。 本研究结果显示，伴HBsAg 感染患者AID 阳性表达率明显高于不伴HBsAg 感染患者。 尽管不同文献报道的DLBCL 患者的HBV 阳性率略有不同，但这些研究都结果表明DLBCL 患者的HBV 阳性率高于健康对照者。结果表明DLBCL 中的AID 与HBV感染具有相关性，AID 可能与DLBCL 中HBV 感染的致病过程有关。 据推测，在HBV 相关的DLBCL中，HBV 感染可以通过慢性刺激连续刺激AID 的表达，从而促进肿瘤的形成，而HBV 感染是否通过某种机制上调AID 的表达， 进一步改变下游靶基因，促进DLBCL 的发生和发展，仍有待进一步研究。

本研究HBsAg（+）和AID（+）患者中位生存时间明显少于HBsAg（+）和AID（-）、HBsAg（-）和AID（+）、HBsAg（-）和AID（-）患者。 这说明AID 可能会加速肿瘤的进展并缩短患者的生存时间，进一步表明AID 对于DLBCL 感染HBV 的预后不良。 多因素分析结果显示，HbsAg 和AID 双阳性、临床分期和IPI 评分是DLBCL 患者预后的影响因素。DLBCL 患者需要在治疗期间密切监测HBV 血清标志物和AID 指标的动态变化，并警惕HBV 再次激活引起的严重肝损害。

DLBCL 发病机制复杂， 且存在多种多样的分子异常，不同的分子异常表达构成了DLBCL 的高度异质性[20]。本研究通过对患者AID 蛋白水平进行检测，表明HBV 也可能通过与AID 相互作用影响DLBCL 发生发展及预后， 支持HBV 可能是DLBCL 发病的重要危险因素之一的假说， 这为HBV相关DLBCL 提供一个可能的研究方向。 由于样本量较少，治疗随访的不一致性、数据的选择偏移等回顾性研究的缺陷， 目前仍然需要一些前瞻性的研究对本结论的进一步证实。

综上所述，伴HBV 感染和不伴HBV 感染DLBCL 患者临床病理学特征有所差异，AID 表达与HBV 感染相关，同时HBV 感染影响患者预后。