PIK3CA基因功能性点突变细胞系的构建和鉴定

郭晓娜,李劲风,胡宗风,朱 伟,李小鹏

(烟台大学药学院,山东省”一事一议“顶尖人才专项实验室,分子药理和药物评价教育部重点实验室(烟台大学),山东 烟台 264005)

PIK3CA基因定位于3q26.3,全长约34 kb,编码I型PI3K催化亚基p110α[1]。PI3K是PI3K-Akt信号通路的重要组成部分,它能够催化合成第二信使磷脂酰肌醇-3,4,5三磷酸(PIP3),驱动各种下游途径,调节多种细胞功能,在癌细胞的生长、增殖[2]、凋亡[3-4]、新陈代谢[5]、迁移[6-7]和分泌[8]等过程中发挥着极其重要的作用。研究表明,PIK3CA体细胞错义突变能够显著提高PI3K的磷脂激酶活性,从而促进正常细胞向癌细胞转化。错义突变热点或反复突变部位主要集中在外显子9和外显子20,其中 H1047R(激酶结构域)、E542K 和E545K(螺旋结构域)三个点突变位点共占据了PIK3CA突变总数的80%～90%[9],但其突变致癌的分子机制仍未清楚。大量的研究数据表明[10],PIK3CA突变在许多癌症中都有发现,特别是在头颈癌(Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)中,PIK3CA突变是发生频率最高的突变,且HPV阳性和阴性头颈癌中PIK3CA突变频率不同,这提示PIK3CA的突变可能与HPV感染有关。

为了考察PIK3CA突变的致癌分子机制,本研究采用CRISPR/Cas9系统介导的同源重组[11]的方法对HPV16阳性和阴性上皮细胞中PIK3CAH1047R位点进行点突变基因编辑,获得功能性点突变细胞系,建立研究PIK3CAH1047R突变致癌分子机制的细胞模型,为后期研发PIK3CA突变相关癌症的靶向药物提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人永生化表皮细胞株,HaCaT,购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。

1.1.2 动物 BALB/c-nu小鼠,雌性,5～6周龄,购自济南朋悦实验动物中心。小鼠全程饲养在烟台大学药学院SPF级标准动物房。饲养环境为12 h∶12 h昼夜交替节律,温度25±2 ℃,提供充足食物和水。所有实验均按照中华人民共和国卫生部和中国医科大学动物保健委员会的指导原则进行。研究方案经烟台大学实验动物伦理委员会批准。

1.1.3 质粒和菌株 LentiCRISPR V2及pGEM质粒由本实验室保存;同源重组H1047R质粒(以下简称synthH1047R)由苏州金唯智生物科技有限公司合成;DH5α感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.4 试剂 Puromycin购自德国MERCK公司;PCR试剂、1 kb Plus DNA Ladder、LipofectamineTM3000 Transfection Reagent转染试剂均购自美国Invitrogen公司;胶回收试剂盒、First Strand cDNA Synthesis Kit均购自Thermo公司;RNAeasyTMPlus动物RNA抽提试剂盒(离心柱式)、LB培养基、Western及IP细胞裂解液、ECL化学发光试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、山羊抗兔二抗均购自上海碧云天生物技术有限公司;PMSF购自Solarbio公司;大提质粒试剂盒购自德国Qiagen公司;限制性内切酶BamHI/BsmBI购自美国NEB公司;pEASY-Blunt Simple Cloning Kit购自Transgene公司;兔抗PIK3CA抗体购自ABclonal公司; Basement Membrane购自美国康宁公司;PI(Propidium Iodide,碘化丙啶)核酸荧光染料购自美国BD公司。

1.1.5 仪器 恒温培养摇床(上海一恒科学仪器有限公司);凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司);流式细胞仪(美国BD公司);PCR仪(德国Eppendorf公司);凝胶电泳仪(美国BIO-RAD公司);莱卡倒置荧光显微镜(德国Leica公司);离心机(德国Eppendorf公司);高速低温组织研磨仪(武汉塞维尔生物科技有限公司);VersaMax全波长酶标仪(美国MD公司)。

1.2 方法

1.2.1 HPV阳性细胞系的构建 环状HPV16载体的获得:将全长HPV16克隆到pGEM BamHI位点, 转化至DH5α感受态细胞,获得pGEM-HPV16菌株。提取质粒,利用BamHI酶切得到全长为8 kb的线性HPV16 DNA;将所得线性HPV16基因组稀释至1 μg/mL,16 ℃条件下T4 DNA连接酶连接12 h,加入无水乙醇沉淀得到环状HPV16 DNA。

HPV阳性细胞株的获得:参照LipofectamineTM3000 Transfection Reagent说明书,将对数生长期HaCaT细胞转移至24孔板中培养过夜,分别转染线性及环状HPV16 DNA质粒。稀释培养后挑取单克隆, PCR扩增单克隆细胞DNA,产物凝胶电泳鉴定阳性克隆。引物序列:HPV16-F GCAATGTTTCAGGACCCACAG,HPV16-R CTTTTCTTCAGGACACAG-

TGGC(上海生工生物工程公司合成)。PCR扩增条件为:94 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,68 ℃延伸45 s。扩增片段大小为347 bp。

1.2.2 HPV阴性及阳性PIK3CAH1047R细胞系的构建 CRISPR/Cas9表达载体的构建:BsmBI酶切LentiCRISPR v2质粒,获得约13 kb的片段作为载体片段;设计两条sgRNA序列:sgRNA-JS2036 CACCGATGAATGATGCACATCATGG,sgRNA-JS2037 AA-

ACCCATGATGTGCATCATTCATC,变性退火得到sgRNA-JS2036/2037双链DNA片段。 T4 DNA连接酶连接上述两个片段,转化,酶切测序确认获得靶向PIK3CAH1047R的CRISPR/Cas9表达载体LentiCRISPR-JL2036/2037。

synthH1047R质粒的设计和合成:synthH1047R模板质粒由苏州金唯智生物科技有限公司合成,为了便于将H1047R突变重组到细胞基因组中,在设计模板时,H1047R的突变位点两侧分别带有250 bp和450 bp大小的上下游同源臂序列;为了增加同源重组的突变克隆概率,减少重组后的突变序列被Cas9二次切割,如图1(a)所示,除H1047 CAT突变为R1047 CGC外,另增加5个同义突变。

基因突变细胞株的获得:参照LipofectamineTM3000 Transfection Reagent说明书,将人永生化表皮细胞HaCaT、HPV16阳性人永生化表皮细胞HaCaT分别转移至6孔板中培养过夜,共转染LentiCRIPR-JL2036/2037 和synthH1047R质粒,并设置LentiCRISPR V2作为阴性对照,利用puromycin(1 μg/mL)进行阳性克隆筛选。抗生素筛选15 d后挑取单克隆,PCR扩增单克隆细胞DNA,测序鉴定PCR扩增产物。引物序列:H1047R-F AAATGGGATAGTGCCTGAGCC,H1047R-R CGACAGCATGCCAATCTCTTC(上海生工生物工程公司合成)。反应条件为:94 ℃变性30 s,61 ℃退火30 s,68 ℃延伸90 s。扩增片段大小为1.3 kb。

1.2.3 突变细胞的验证 Western Blot检测蛋白表达:在100 mm×20 mm培养皿中培养突变细胞至对数生长期,胰酶消化后加完全培养基去消化,4 ℃、1 500 r/min离心5 min,收集沉淀,加300 μL细胞裂解液(297 μL Western及IP细胞裂解液+3 μL PMSF,现用现配)于低温高速组织研磨仪中研磨15 min;研磨完毕后,4 ℃、12 000 r/min离心15 min,收集上清,同时用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。取80 μL Western及IP细胞裂解液加入20 μL 5×上样缓冲液,进行蛋白SDS电泳,湿法转膜后用奶粉封闭。封闭结束后,1×TBST漂洗三次,每次10 min,兔抗PIK3CA抗体4 ℃过夜孵育。一抗孵育结束后,1×TBST漂洗三次,每次10 min,山羊抗兔二抗室温孵育2 h,1×TBST漂洗三次,每次10 min,ECL发光显色液显色。

TOPO克隆验证突变细胞比例:参照pEASY-Blunt Simple Cloning Kit说明书,T4 DNA连接酶连接pEASY-Blunt Simple载体与H1047R阳性克隆PCR反应产物,转化至DH5α感受态细胞,过夜培养并随机挑选24个单克隆,以M13F/R为引物进行PCR扩增,测序验证突变细胞比例。

突变基因表达测序:RNAeasyTMPlus动物RNA抽提试剂盒(离心柱式)提取H1047R阳性克隆RNA,产物经First Strand cDNA Synthesis Kit反转录得到cDNA。以cDNA为模板,以H1047R-F/R为引物进行PCR扩增,测序验证突变基因表达。

皮下接种验证突变细胞成瘤性:培养细胞至对数生长期,胰酶消化后加完全培养基去消化获得细胞悬液,取1.5×107个/mL的细胞悬液100 μL与100 μL Basement Membrane混匀后,皮下注射于小鼠右侧背部(每种细胞接种4只),待肿瘤生长至100～150 mm3左右,每隔3 d测量一次肿瘤体积,绘制成瘤曲线。肿瘤体积计算公式为:肿瘤体积(mm3)=1/2×(a×b2)(其中a表示长径,b表示短径)。

PI标记法检测细胞周期:取对数生长期的突变细胞(1×106个细胞),4 ℃、1 500 r/min离心收集细胞沉淀并用预冷的PBS洗涤两次,弃上清;逐滴加入5 mL预冷的70%乙醇,混匀细胞,于4 ℃固定4 h以上;1 500 r/min离心5 min,弃上清,用预冷的的PBS清洗两次,每个样本加入500 μL染色剂,避光染色30 min;利用流式细胞仪(美国BD公司)检测细胞周期,计数2～3万个细胞,利用细胞周期拟和软件ModFit分析结果。

2 结 果

2.1 测序鉴定阳性克隆

以HPV16-F/R为引物,PCR扩增HPV16基因组片段凝胶电泳鉴定HPV16阳性克隆;以H1047R-F/R为引物,PCR扩增测序鉴定PIK3CAH1047R点突变。图1(b) HPV16琼脂糖凝胶电泳结果表明,HPV16基因能够在HPV16+H1047R Clone304中稳定遗传,图1(c) H1047R测序结果表明,H1047R突变克隆Clone102、103、204及304都存在H1047R突变。以上结果证明,HPV16阳性及阴性PIK3CAH1047R突变细胞系构建成功。

图1 PIK3CA突变细胞系的鉴定

2.2 Western Blot检测蛋白表达

用Western Blot检测PIK3CA基因的表达,图2(a)表明突变后细胞仍能正常表达PIK3CA基因。

2.3 TOPO克隆验证突变细胞比例

上述实验结果表明突变细胞构建成功,且能正常表达PIK3CA基因编码蛋白。为了进一步验证突变细胞等位基因的比例,通过TOPO克隆实验将单个PCR条带转入DH5α感受态细胞,挑取24个单克隆菌株PCR扩增后测序,估算阳性突变细胞比例[12]。图2(b)中,对H1047R Clone103的TOPO实验结果表明,除无结果的2个克隆以外,22个单克隆细胞株中,4/22是野生型的PIK3CA等位基因,18/22是基因组PIK3CAH1047R突变的等位基因。

2.4 突变基因表达测序

通过测序鉴定突变细胞中RNA反转录产物的目标基因,验证突变细胞系是否表达突变基因。提取阳性突变细胞RNA,反转录得到cDNA,PCR扩增cDNA产物并测序。图2(c)中测序结果表明,Clone204均存在H1047R突变型基因的表达,Clone103部分存在H1047R突变型基因表达,初步证实阳性突变细胞系能够顺利表达突变基因产物。

图2 PIK3CA突变细胞系的鉴定

2.5 皮下接种验证突变细胞成瘤性

分别在裸鼠皮下以1.5×106个/只、每种细胞4只的接种量接种HaCat、HPV16转染的HaCat和PIK3CAH1047R突变克隆102、103、204及克隆304细胞,每隔3 d进行肿瘤生长观察和测量。图3为根据各组平均瘤体积绘制而成的肿瘤生长曲线,对各组数据进行ANOVA分析表明,HaCat及HaCat HPV16细胞不具备体内成瘤性,而PIK3CAH1047R点突变的HaCat克隆特别是克隆102和103有很强的体内成瘤性。

图3 Hacat、HPV16转染的HaCat和PIK3CA H1047R突变HaCat克隆的裸鼠成瘤实验结果

2.6 PI标记法检测阳性克隆细胞周期

PI染料标记细胞DNA,流式细胞仪检测细胞DNA分布状态,计算各个细胞周期时相的百分含量,分析对比细胞的增殖能力。对细胞周期的分析结果表明(图4),与未突变细胞的S期(6.62%)相比,突变细胞的S期(52.2%、29.1%、43.5%、30.7%)占比明显增多,说明突变后细胞增殖明显加快。

图4 流式细胞仪检测结果

3 讨 论

在构建H1047R突变的过程中,由于CRISPR系统对突变序列的耐受性,特别是sgRNA的非种子区突变,通常会导致同源重组区的单碱基突变基因被CRISPR序列二次切割,从而大大降低突变基因的重组率[13]。为了改善这一现状,在设计sgRNA的结合区域时,加入了5个同义突变。该突变使得sgRNA难以与重组突变序列配对,从而增加突变基因的重组率,产生高效单碱基突变。

高效单碱基突变细胞株的获得可通过TOPO克隆实验证明。对H1047R Clone103的TOPO克隆结果表明,该细胞株突变型和野生型等位基因比例为18∶4,大大超过1∶1的正常比例。分析认为,这种现象产生的原因很可能是在克隆产生的过程中,CRISPR Cas9系统在部分细胞中获得了两个等位基因突变,且双拷贝的PIK3CA突变的细胞比单拷贝的PIK3CA突变的细胞具有相对生长优势。过往研究表明,HPV阴性和阳性头颈癌中,PIK3CA在大部分临床样品中不只有突变一种形式,还存在扩增[14-16]。因此,这种克隆并不会对后续PIK3CA突变的研究产生较大影响,甚至该突变克隆极可能是研究PIK3CA功能性突变最好的细胞系。

HaCat和PIK3CA突变克隆的裸鼠成瘤实验显示PIK3CA功能区H1047R点突变可将不致瘤的HaCat细胞转变为成瘤性细胞,进一步说明该PIK3CA突变是肿瘤的驱动突变,并且这些突变细胞系的建立在PIK3CA突变的功能研究和针对突变的药物研发上具有重要的意义。FACS细胞周期检测结果表明:与野生型相比,PIK3CA突变克隆的S期细胞显著增加,细胞增殖明显加快。接下来的实验将进一步研究PIK3CA突变直接或间接介导哪些细胞周期基因的表达调控。同时,可对PIK3CA突变细胞系进行全转录组、蛋白组的研究。除此之外,还可通过对比PIK3CA突变的HPV阴性和阳性细胞系,找出这两类临床表现完全不同的头颈癌肿瘤特性。构建成功的PIK3CA突变细胞系也可用于全基因组的合成致死突变的筛选,得到针对PIK3CA突变的新靶点。这些工作将加快PIK3CA突变靶向治疗药物的开发。

4 结 论

上述实验结果表明,HPV16阳性及阴性PIK3CAH1047R突变细胞系已构建完成,且能正常表达H1047R突变型基因。对该突变细胞系的进一步研究表明,突变后细胞增殖速度明显加快,具有很强的体内成瘤性。该H1047R功能性点突变细胞系的建立将为进一步揭示PIK3CA突变的致癌分子机制,研发针对PIK3CA突变癌症的靶向药物开发和临床治疗提供理论基础。