八个海棠品种叶片营养成分与抗氧化活性分析

许申平，袁秀云，吉长献，王默霏，张燕，蒋素华，牛苏燕，崔波*

1(郑州师范学院,生物工程研究中心，河南 郑州，450044)2(巩义市天泽农林有限公司，河南 巩义，451200)

海棠(Malusspp.)为蔷薇科苹果属(MalusMill.)的落叶乔木或者小乔木，大部分品种具有极强的适应性和抗逆性[1]，是干旱贫瘠地区的重要建群种和生态树。虽然海棠的主要用途是观赏，但因其花、叶和果实中含有丰富的生物活性和营养成分[2-4]，海棠已成为食物加工、营养产品和药物开发的重要资源之一。海棠具有显著的抗氧化能力，果实富含丰富的黄酮类化合物，已成为研究黄酮类化合物生物合成分子机制的有价值模型[5]。以海棠果实为原料开发的相关产品如苹果酒、醋、果汁等深受消费者欢迎[6]。海棠叶片营养丰富，除了丰富的酚类化合物和黄酮，还含有多种人体所需的蛋白质、糖类、维生素、钙、磷、铁、镁等矿质元素。海棠叶片常被制成茶饮和饮料[7]，其中以海棠叶作为茶饮在三峡地区已有几百年历史[8]。同时，海棠的多种药理活性在药用保健方面也有很大开发前景[9]。从海棠叶片和果实中分离得到的二氢查耳酮类化合物对多种人类癌细胞具有显著的抗癌活性[10-11]。随着对海棠功能性成分的深入研究，海棠副产品加工的开发利用已逐渐引起人们的重视，副产品不但可应用于了食品、医药和天然化妆品行业，同时也可以变废为宝，减少资源的浪费，具有重要的经济和社会价值。

我国海棠栽培历史悠久，资源丰富[12]。近几年对海棠的研究取得了一定的成果，主要集中在海棠种质资源、新品种选育和抗氧化活性等方面，而在产品开发利用方面的研究仍局限在传统的“海棠四品”(湖北海棠、西府海棠、垂丝海棠和贴梗海棠)中[13]，致使大部分优良海棠品种的叶、花朵和果实的价值没有充分利用而被废弃在田间。海棠品种间的叶片营养成分与抗氧化活性之间存在一定差异[2,14]，为探究叶片营养成分和抗氧化活性较高的海棠品种，本试验选取河南省巩义市广泛栽植的8种海棠为试验材料，对其叶片主要营养成分、矿物元素和抗氧化活性进行分析，旨在为海棠叶片的合理开发和充分利用提供理论依据。同时，研究结果也可为研究海棠品种的理化特性提供重要信息，为提高海棠的价值和选择优良的海棠基因型进行商业栽培提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本试验研究区位于河南省巩义市，材料选自于大峪沟镇的千亩海棠基地。选取的具体品种为垂丝海棠(M.halliana)、西府海棠(Malus.micromalus)、“沂蒙甜茶”(‘Sweet tea’)、“凯尔斯”(‘Kelsy’)、“冬红”(‘Winter red’)、“绚丽”(‘Radiant’)、“红丽”(‘Red splendor’)和“世标1号”(‘Shibiao 1’)，共8个海棠品种。供试材料均为7年生海棠成树，树体无病虫害，生长良好。每个品种随机选择3株，于2019年9月下旬采集1年生枝新梢顶部往下第4片叶，在实验室流水冲洗干净，105 ℃、30 min杀青，80 ℃、48 h 烘干，密封包装，常温放置备用。

1.2 仪器与设备

UV-2600 紫外可见分光光度计，日本岛津公司；OGS100 烘箱、MIRCOCL 17R 离心机、iCAP 7200 HS Duo 电感耦合等离子发射光谱仪、Multiskan GO 1510 全波长酶标仪，美国Thermo公司；DHG-9035A 鼓风干燥机，上海慧泰仪器制造有限公司；FP6431 火焰光度计，上海仪电分析仪器有限公司；AX205DR 天平，METTLER TOLEDO；DK-S24 水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；JXFSTPRP-CL 冷冻研磨仪，上海净信实业发展有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 营养成分含量的测定

海棠叶片可溶性糖含量采用蒽酮硫酸的方法进行测定[15]。海棠叶片可溶性蛋白含量测定采用牛血清蛋白法[16]；氨基酸含量参考CHEN等[17]的方法；粗纤维含量的测定按照标准GB/T 5009.10—2003的具体方法进行；矿质元素的含量参照GB 5009.268—2016的方法进行测定。

1.3.2 抗氧化活性物质的测定

海棠叶片总酚含量、类黄酮和自由基清除能力选取试剂盒进行测定，试剂盒来自于苏州科铭生物技术有限公司。

1.4 数据处理

运用Excel 2010和SPSS 20.0软件进行数据处理和相关性分析，所有样品均进行3次重复，结果以平均值±标准差的形式进行表示。

2 结果与分析

2.1 海棠叶片形态

如图1所示,8个栽培海棠品种叶片形态有较大差异，颜色以绿色为主色，“绚丽”和垂丝海棠的绿色较浅，“凯尔斯”、“冬红”和“红丽”的颜色较深，而西府海棠叶片的颜色最深。海棠叶片大小因品种不同差异显著，叶片最大的是“沂蒙甜茶”，叶面积达到32.42 cm2，比最小叶片垂丝海棠的叶面积大180%；“冬红”叶面积稍小于“沂蒙甜茶”，面积为26.15 cm2。

表1 八个海棠品种叶面积数据 单位：cm2

图1 不同海棠品种叶片形态Fig.1 The morphology in leaves of different crabapple cultivars

2.2 海棠叶片营养物质含量

2.2.1 叶片可溶性糖含量

可溶性糖是植物内部重要的有机物，在茶品中也是主要的水浸出物之一。不同海棠品种叶片可溶性糖的含量呈现显著差异(表2)，其中含量最高的是“世标1号”，其次是“冬红”和西府海棠，三者平均含量达到87.93 mg/g；“沂蒙甜茶”和“凯尔斯”可溶性糖的含量有所降低；“绚丽”的含量达到最低，其次是垂丝海棠和“红丽”，最低的含量平均是37.37 mg/g，比最高组含量低57.50%。

2.2.2 叶片可溶性蛋白含量

本研究中海棠叶片的平均可溶性蛋白含量为262.83 mg/g，品种间存在显著差异。“世标1号”的含量最高，达到338.86 mg/g；其次是“冬红”和西府海棠；叶片可溶性蛋白的含量最低的是绚丽海棠，仅有182.83 mg/g。8种海棠叶片的可溶性蛋白含量排序为：“绚丽”<“红丽”<“凯尔斯”<“沂蒙甜茶”<垂丝海棠<西府海棠<“冬红”<“世标1号”，含量最低的“绚丽”比含量最高的“世标1号”低84.34%。

2.2.3 叶片氨基酸含量

根据表2可知，8个品种海棠叶片均含有氨基酸，平均含量为70.26 mg/g，氨基酸的总量最低为57.13 mg/g，最高为88.78 mg/g，其中“冬红”的总氨基酸含量最高，“绚丽”的最低。“冬红”的氨基酸含量比8个海棠叶片的平均值高26.40%，比最低的“绚丽”高55.40%。不同海棠品种叶片中氨基酸组成达到显著差异(P<0.05)。

表2 海棠叶片营养成分比较分析 单位：mg/g

2.2.4 矿质元素含量

海棠叶片含有十分丰富的矿质元素(图2)。在测定的3种常量元素中，Mg和K的含量稍低，Ca的含量相对较高。Mg的含量为4.00～7.57 g/kg，其中“红丽”的Mg含量最高，其次是“冬红”，“绚丽”叶片的Mg含量最低。K的含量变化为5.98～9.37 g/kg，含量最高的是“沂蒙甜茶”，其次是“凯尔斯”，含量最低的是垂丝海棠。Ca含量位于13.23～22.11 g/kg，“凯尔斯”和“冬红”含量最高，约为22 g/kg，“绚丽”含量最低。微量元素的测定表明，海棠叶片含有丰富的Fe元素，供试的8种海棠叶片平均含Fe量为247.35 mg/kg，含量最高的为“沂蒙甜茶”，其次为“世标1号”和“冬红”，含量最低的为西府海棠。Mn的含量比Fe含量低，其含量为29.28～72.54 mg/kg，含量最高的为“世标1号”，含量最低的为“沂蒙甜茶”。与Fe和Mn相比，Zn和Cu的含量相对较低。Zn的含量在8.22～14.87 mg/kg，“冬红”的Zn含量最高，“绚丽”的Zn含量最低。Cu含量为7.6～9.44 mg/kg，“世标1号”的Cu含量最高，最低的是“绚丽”。

图2 海棠叶片矿质元素的含量分析Fig.2 Analysis of mineral element contents in the leaves of crabapples注：数据柱上不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)

2.2.5 叶片的矿质元素与营养成分相关性分析

对海棠叶片的矿质元素与营养成分(可溶性糖、可溶性蛋白和氨基酸)进行相关性分析发现，大部分的矿物元素与可溶性糖及可溶性蛋白的相关性都没有达到显著水平(表3)。海棠叶片矿质元素Cu的含量与可溶性糖含量成负相关，并达到显著水平，相关系数0.580。矿物元素和可溶性蛋白之间的相关性并没有达到显著水平；大部分矿物质元素则和氨基酸的含量相关性均达到显著水平，其中氨基酸与大部分矿质元素都有显著的正相关，但Fe与氨基酸的含量则有显著的负相关。

表3 海棠叶片矿物元素与主要营养成分的相关性分析Table 3 The correlation of mineral elements and main nutritional components of crabapple

2.3 叶片抗氧化活性物质

2.3.1 叶片类黄酮与总酚的含量

8种海棠叶片类黄酮的平均含量为48.34 mg/g，总体含量为37.46～58.27 mg/g(图3)。类黄酮含量最高的品种为“冬红”，比8种供试海棠的平均值高20.53%，比最低含量的“绚丽”高55.54%；垂丝海棠叶片类黄酮的含量也较高，仅比“冬红”低3.17 mg/g，比8种供试海棠的平均值高13.97%，比最低含量的“绚丽”高47.07%。

图3 八个海棠品种类黄酮和总酚含量的比较Fig.3 Comparative contents of flavonoids and total phenols in eight crabapple cultivars

8种海棠叶片的总酚含量平均为94.95 mg/g，其含量范围为70.66～133.49 mg/g，且不同海棠品种之间叶片的总酚含量存在显著差异(P<0.05)。“冬红”叶片的总酚含量显著高于其他种类，其含量是8种海棠叶片的总酚均值的1.41倍，是最低含量“绚丽”的1.89倍；垂丝海棠的总酚含量虽然低于“冬红”16.72%，但仍明显高于其他品种，其含量是8种海棠叶片总酚平均值的1.17倍，是最低品种“绚丽”含量的1.57倍。

2.3.2 自由基清除能力

抗氧化能力常用清除DPPH自由基和ABTS阳离子自由基的能力来评价。本研究中，供试的海棠品种清除DPPH自由基与ABTS阳离子自由基的能力均较强(图4)。海棠叶片DPPH自由基的清除率为86.20%～92.79%，品种之间存在显著差异(P<0.05)：叶片中DPPH自由基的清除能力最强的是“冬红”和垂丝海棠，都达到90%以上；“沂蒙甜茶”和“绚丽”叶片中DPPH自由基的清除能力较弱，分别是86.20%和87.25%。8种海棠叶片ABTS阳离子自由基的清除率为79.47%～92.71%，在不同海棠品种之间差异显著(P<0.01)：其中垂丝海棠和“冬红”叶片的ABTS阳离子自由基清除能力较强，清除率均大于90%；“绚丽”和“世标1号”叶片中ABTS阳离子自由基的清除能力最弱，清除率仅为79%。

2.3.3 海棠叶片类黄酮含量、总酚含量与抗氧化活性的相关性分析

海棠叶片的类黄酮含量、总酚含量、DPPH自由基清除力和ABTS阳离子自由基清除力呈现显著正相关(表4)。类黄酮与总酚含量、ABTS阳离子自由基和DPPH自由基清除能力显著正相关，其中与总酚含量和ABTS阳离子自由基清除能力相关系数达到极显著水平(P<0.01)。总酚含量与DPPH自由基清除力和ABTS阳离子自由基清除力都呈现极显著正相关，相关系数分别为0.600和0.580。ABTS阳离子自由基与DPPH自由基清除力之间呈极显著正相关，相关系数是0.619。

图4 海棠叶片清除DPPH和ABTS阳离子自由基清除的能力Fig.4 Activity of DPPH and ABTS cationic radical-scavenging in crabapple leaves

表4 类黄酮含量、总酚含量和抗氧化活性相关性分析Table 4 The correlation of flavonoids, total phenols and antioxidant activity

2.4 海棠叶片品质性状与抗氧化活性的主成分分析

对海棠叶片的12个指标的主成分分析发现(表5)，主成分特征值大于1的共有4个，累计方差的贡献率为94.15%，可代表海棠叶片大部分指标的信息。第1主成分特征值是5.653，贡献率是47.11%，其中氨基酸和常量元素(Mg、K、Ca)在第1主成分中有较高载荷，且载荷均为正值。第2主成分的特征值为3.407，贡献率是28.39%，其中可溶性蛋白、总酚和类黄酮在第2主成分中具有较高的载荷，载荷均为正值。第3主成分的特征值为1.139，贡献率为9.49%，其中Fe、Zn和Cu在第3主成分有较高的正载荷。第4主成分的特征值为1.098，贡献率为9.154%，其中可溶性糖和Mn在第3主成分具有较高载荷，且载荷均为正值。根据主成分综合模型得出8种海棠叶片品质成分的综合评价，其叶片营养成分和抗氧化活性的综合得分排序为：垂丝海棠<西府海棠<“沂蒙甜茶”<“绚丽”<“世标1号”<“红丽”<“凯尔斯”<“冬红”。

表5 八种海棠叶片营养物质和抗氧化性能主成分分析Table 5 Principal component analysis of nutraceutical compounds and antioxidant properties of eight crabapple cultivars

3 结论

栽培海棠因品种不同其叶片的营养成分都有显著差异。糖类物质是茶汤重要呈味物质之一，在一定程度上能削减苦涩味[18]。本研究中，西府海棠、“冬红”和“世标1号”叶片的可溶性糖的含量都大于 80 mg/g，这对于海棠茶叶总体口感将有一定的改善作用。本研究中“世标1号”海棠叶片可溶性蛋白的含量为338.86 mg/g，“冬红”总氨基酸含量为88.78 mg/g，这与王海英等[4]研究认为海棠叶片氨基酸和蛋白质的含量丰富的研究结果一致。海棠叶片蛋白质含量丰富，可促使其作为新型植物蛋白源，提供较高的营养成分[19]。本次试验所选的8种海棠叶片皆具有非常丰富的常量元素及微量元素。Ca和Fe都是人体内最重要的矿物元素；但两者元素又是人类膳食中最易缺乏的重要营养素之一。“凯尔斯”和“冬红”的Ca元素含量达到22 g/kg，“沂蒙甜茶”的Fe元素含量高达291 mg/kg，高于湖北海棠叶片的Ca和Fe元素的含量[8]。“凯尔斯”和“冬红”叶片可以作为补充Ca元素的良好来源，“沂蒙甜茶”叶片可以作为补充Fe元素的良好来源。海棠叶片如此丰富的矿质元素和营养成分，为功能与保健型天然绿色产品重新开辟了新的途径。

类黄酮和总酚不仅是植物代谢中具有抗性作用的重要次生物质[20-21]，而且在抗衰老、抗氧化和降血脂等方面皆具有一定作用[22-23]，该指标的含量是评价植物营养和保健功能的重要指标[24]。海棠叶片的类黄酮及总酚含量因品种不同有显著差异，早期研究在湖北海棠、王族海棠和雪球海棠等栽培品种中都发现叶片含有丰富的酚类物质[2,14]。本研究中8种海棠叶片类黄酮的含量为37.46～58.27 mg/g，平均为48.34 mg/g；总酚含量为70.66～133.49 mg/g，平均为94.95 mg/g，其中“冬红”的含量最高。这一结果进一步证实海棠叶片有望开发成功能性食品或者可作为提取天然黄酮和总酚的原料。多酚的含量往往与自由基清除能力呈现正相关，同时在药理方面也具有较强活性[25]。本研究发现8种海棠叶片去除DPPH自由基和ABTS阳离子自由基的效果均较强，其中“冬红”和垂丝海棠叶片清除DPPH自由基与ABTS阳离子自由基能力皆达到90%以上，可进行抗氧化与抗衰老相关的海棠叶片新产品开发。

总之，本文中的8种供试海棠叶片中的营养物质和抗氧化活性物质都含量较高，在食用和药用方面皆具有重要价值，是非常值得开发利用的珍贵山区植物资源。同时，本研究结果对海棠叶片药用价值和生理保健功能具有积极意义。