B细胞、CD4+CD25+Treg比例与胃癌患者TNM分期、淋巴结转移的关系及对患者生存时间的预测*

李 强，黄思宇△，闵 倩，张洪涛，谢 猛

安徽省阜阳市第二人民医院：1.肿瘤科；2.检验科，安徽阜阳 236015

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。该病每年的发病率约为17/10 000，严重影响了患者的健康和安全，并给患者家属造成了巨大经济负担[1]。目前，胃癌的临床疗效不显著，预后不良，尤其是进展期胃癌。尽管部分患者进行了根治性胃切除术，但5年生存率仅为20%左右，因此，对胃癌发病机制的研究有助于提高临床疗效和改善预后[2]。有研究发现，胃癌可由多种复杂的内、外因素引起，这些因素导致细胞结构破坏和基因表达异常，胃癌的发生和发展可能与多种癌基因和淋巴细胞(包括B细胞)的激活以及抑癌基因的失活有关[3]。另有研究发现，CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)属于CD4+Treg亚群，与肿瘤免疫抑制有一定关系，其可以调节CD4+和CD8+的激活和增殖，并调节免疫应答[4]。目前，关于Treg与胃癌病理特征相关性的研究较少。基于此，本文主要探讨了B细胞、CD4+CD25+Treg的表达与胃癌患者TNM分期、淋巴结转移的关系，并分析了上述细胞表达情况对患者预后生存时间的预测价值，旨在为临床胃癌的诊断和治疗提供一定的参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2015年1月至2017年12月本院收治的胃癌患者80例作为胃癌组。纳入标准：(1)通过胃镜或病理检查证实为胃癌；(2)入组前未进行放化疗；(3)临床资料完整；(4)所有患者均知情同意参与本研究；(5)均无认知障碍。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤；(2)凝血功能异常；(3)无法完成本研究所有检查项目；(4)检查结果无效；(5)中途退出研究。胃癌组中男52例，女28例；年龄35～75岁，平均(50.12±5.23)岁；肿瘤最大径：≤5 cm共38例，>5 cm共42例；TNM分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期12例，Ⅲ期40例，Ⅳ期8例；分化程度：高分化13例，中分化23例，低分化44例；肿瘤位置：胃体41例，幽门及胃窦19例，贲门及胃底20例；病理类型均为胃腺癌，其中管状腺癌33例，乳头状腺癌27例，黏液腺癌20例；发生淋巴结转移52例，未发生淋巴结转28例。选取同期在本院体检的健康者50例作为对照组，其中男32例，女18例；年龄35～75岁，平均(51.03±6.02)岁。两组性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1B细胞水平的检测 将正常胃组织和胃癌组织获得的淋巴细胞调到2×109/L后进行离心，在试管中加入40 μL CD4+试剂和40 μL CD19+试剂，重悬，室温下避光孵育15 min；磷酸盐缓冲液洗涤后，用流式细胞仪检测并用软件分析。

1.2.2CD4+CD25+Treg比例的检测 采集所有研究对象清晨空腹外周静脉血5 mL，肝素抗凝后，用梯度离心法分离淋巴细胞，用不含胎牛血清1640培养基洗涤两次，然后用含1%胎牛血清的完全1640培养基进行重塑，接着将淋巴细胞计数并稀释至1×106/mL，取1 mL细胞悬液于试管中，1 500 r/min离心10 min，弃上清液，分别将20 μL异硫氨酸荧光素(FITC)标记的CD4抗体和20 μL荧光素PE标记的CD25抗体在4 ℃冰箱中暗孵30 min，然后离心，用1%胎牛血清蛋白-磷酸盐缓冲液洗涤两次，稀释至300 μL；用贝克曼库尔特Gallios流式细胞仪(苏州赛恩斯仪器有限公司)测定淋巴细胞表面各荧光素的荧光强度，并用空白和阴性对照消除非特异性和自发荧光。每次分析10 000个细胞，用二维dot-p1ot散点图保存，在FITC-CD4/PE-CD25双参数图上计算CD4+CD25+Treg比例，CD4+CD25+Treg比例=CD4+CD25+Treg/CD4+Treg×100%。

1.3观察指标 (1)比较两组外周血B细胞、CD4+CD25+Treg比例；(2)比较不同TNM分期、淋巴结转移的胃癌患者B细胞、CD4+CD25+Treg比例的差异；(3)分析B细胞、CD4+CD25+Treg比例与胃癌患者TNM分期、淋巴结转移的关系；(4)记录所有胃癌患者随访的生存情况。所有患者随访3年，共失访2例，胃癌组失访1例，对照组失访1例，失访原因均为更换联系方式或联系方式错误。

2 结 果

2.1两组外周血B细胞、CD4+CD25+Treg比例比较 胃癌组外周血B细胞水平低于对照组(P<0.05)，CD4+CD25+Treg比例高于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 两组外周血B细胞、CD4+CD25+Treg比例比较

2.2不同TNM分期、淋巴结转移的胃癌患者B细胞、CD4+CD25+Treg比例比较 不同TNM分期、淋巴结转移的胃癌患者B细胞、CD4+CD25+Treg比例差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 不同TNM分期、淋巴结转移的胃癌患者B细胞、CD4+CD25+Treg比例比较

2.3B细胞、CD4+CD25+Treg比例与胃癌患者TNM分期的关系 以TNM分期(定义“Ⅰ期”=1，“Ⅱ期”=2，“Ⅲ期”=3，“Ⅳ期”=4)作为因变量，将不同TNM分期胃癌患者外周血B细胞、CD4+CD25+Treg比例作为自变量，纳入多元线性回归模型，结果显示，胃癌患者外周血B细胞、CD4+CD25+Treg比例与TNM分期均存在相关性(P<0.05)，见表3。

表3 B细胞、CD4+CD25+Treg比例与胃癌患者TNM分期的关系

2.4B细胞、CD4+CD25+Treg比例与胃癌患者淋巴结转移的关系 以淋巴结转移(定义“是”=1，“否”=2)作为因变量，将不同淋巴结转移胃癌患者外周血B细胞、CD4+CD25+Treg比例作为自变量，纳入多元线性回归模型，结果显示，胃癌患者外周血B细胞、CD4+CD25+Treg比例与淋巴结转移均存在相关性(P<0.05)，见表4。

表4 B细胞、CD4+CD25+Treg比例与胃癌患者淋巴结转移的关系

2.5B细胞对胃癌患者生存时间的预测 随访半年，B细胞低表达患者有62例，平均生存时间为(24.06±5.13)个月；高表达患者17例，平均生存时间为(34.09±5.22)个月，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.6CD4+CD25+Treg细胞对胃癌患者生存时间的预测 CD4+CD25+Treg细胞高表达患者60例，平均生存时间为(23.17±5.09)个月；低表达患者19例，平均生存时间为(35.12±5.07)个月，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

胃癌常发生在胃黏膜和胃腺上皮中。最常见的组织学类型是腺癌，发生在胃窦的小弯曲处[5]。近年来，虽然全世界胃癌患者的发病率和病死率呈缓慢下降趋势，但由于国内人口老龄化较严重，新发胃癌患者数量仍居高不下，病死率仍处于我国疾病病死率的前列[6]。虽然约55%的胃癌患者在治疗时仅表现为非特异性胃肠道消化不良，且在胃癌早期通常没有明显症状，大多数患者就诊时已进展到胃癌晚期，只能通过彻底的淋巴结清扫进行保守治疗[7]。晚期患者手术预后差，并发症多，因此找到可预测其生存时间的指标对于降低患者的病死率具有十分重要的临床意义。

B细胞作为体液免疫的重要介导细胞，主要在抗原刺激下分化为浆细胞，产生免疫球蛋白(Ig)，参与体液免疫[8]。有研究发现，被肿瘤组织浸润的B细胞可以产生IgG抗体，识别肿瘤组织中的抗原并抑制其生长[9]。CD4+CD25+Treg是CD4+Treg亚群的成员，其可能导致机体免疫功能降低，以及白细胞介素-2水平升高，使抗CD3和抗CD28单克隆抗体的联合作用处于无反应状态。此外，其还具有免疫抑制作用，表现为在细胞抗原受体接收激活的信号刺激后，抑制CD4+和CD8+细胞的活化和增殖[10]。以往的研究发现，CD4+CD25+Treg在预防免疫性疾病、抑制神经系统疾病和肿瘤免疫反应中起着非常重要的作用[11]。其作用不依赖于细胞因子，而仅通过细胞间接触[12-13]。目前，关于CD4+CD25+Treg与胃癌患者临床特征的关系研究较少。探讨其相关性有助于胃癌早期诊断、客观评估病情，为临床治疗提供参考依据。

本研究结果显示，胃癌组外周血B细胞水平低于对照组(P<0.05)，CD4+CD25+Treg比例高于对照组(P<0.05)；本研究结果还显示，不同TNM分期、淋巴结转移的胃癌患者B细胞、CD4+CD25+Treg比例差异均有统计学意义(P<0.05)；进一步分析发现，胃癌患者外周血B细胞、CD4+CD25+Treg比例与TNM分期、淋巴结转移均存在相关性(P<0.05)，提示B细胞、CD4+CD25+Treg比例可对胃癌患者的TNM分期、淋巴结转移产生一定的影响。相关研究结果显示，在淋巴细胞性间质性胃癌中，B细胞高浸润组分化程度较高，TNM分期较低；EB病毒(EBV)阴性淋巴细胞间质性胃癌中，B细胞高侵袭组TNM分期低于低侵袭组，提示B细胞可能有助于降低肿瘤TNM分期[14]。另有研究显示，胃癌患者术前外周血CD4+CD25+Treg比例在不同TNM分期患者中差异有统计学意义(P<0.05)，Ⅲ期和Ⅳ期胃癌患者外周血CD4+CD25+Treg比例明显高于Ⅰ期(P<0.05)，Ⅳ期胃癌患者外周血CD4+CD25+Treg比例也明显高于Ⅱ期(P<0.05)，提示TNM分期越高，术前外周血CD4+CD25+Treg比例越高[15]。上述结果提示，在肿瘤进展过程中，外周血中CD4+CD25+Treg的水平增加，说明外周血CD4+CD25+Treg可能影响肿瘤的进展。另外，生存分析发现，不同B细胞、CD4+CD25+Treg比例的胃癌患者的生存时间差异有统计学意义(P<0.05)，提示B细胞、CD4+CD25+Treg可作为预测胃癌患者预后的指标。

综上所述，胃癌患者的外周血B细胞水平降低，CD4+CD25+Treg比例增加，胃癌患者外周血B细胞、CD4+CD25+Treg比例与TNM分期、淋巴结转移均存在相关性，外周血B细胞、CD4+CD25+Treg可作为预测胃癌患者预后情况的指标。