酱香型白酒酿造过程中微生物多样性及代谢过程研究进展

刘 正，秦培军，卢延想，吴知非，张长霞，李细芬，梁慧珍*

（1.贵州国台酒业集团股份有限公司，贵州 仁怀 564501；2.天津科技大学 生物工程学院，天津 300457）

中国白酒源远流长，酱香型白酒更是享誉世界，深受国内外消费者好评。相较于其他香型白酒，酱香型白酒酿造过程中具有高温制曲、高温堆积、高温发酵、大量用曲和多轮次发酵的特点。生产流程中复杂的微生物变化及相关代谢过程一直是业内研究的重点。

茅台镇独一无二的酿造环境与大量酿酒功能微生物长期选择性富集直接相关[1]。酿造功能微生物主要有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌，细菌主要产蛋白酶与酱味物质；霉菌是糖化动力来源；酵母主要产酒产香；放线菌代谢的次级代谢产物对微生态具有一定生物调控作用[2]。不同酿造工序中微生物组成、丰度各不相同；各种微生物形成复杂的微生态系统，伴随着大量微生物动态变化、能量传递及物质生成。研究酱酒酿造过程中微生物多样性及代谢过程有利于科学溯源酱香型白酒风味物质，对优化生产工艺，提高产品质量有重要指导意义。

1 酱香型白酒酿造过程中细菌多样性及代谢过程研究

1.1 酱香型白酒酿造过程中细菌多样性

所谓“曲是酒之骨”，高温大曲作为酱香型白酒酿造过程中重要的糖化剂及生香剂，为白酒酿造提供微生物动力，与酒质密切相关。高温大曲以芽孢杆菌（Bacillus）、乳酸菌（Lactobacillus）和醋酸菌（Acetobacter）为主，伴随少量霉菌、放线菌及微量酵母菌[3-4]。大曲发酵过程呈高温高湿状态，细菌数量整体呈升高趋势；酵母菌和霉菌数量呈降低趋势。不同发酵阶段大曲中细菌组成变化明显，各阶段优势细菌如表1所示[5]。

表1 不同发酵阶段高温大曲优势微生物Table 1 Dominant microorganisms of high temperature Daqu during different fermentation stages

柳习月等[6]指出高温大曲中优势细菌主要为克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia）、芽孢杆菌属、高温放线菌属和糖多孢菌属（Saccharopolyspora），总相对丰度平均为85.65%。通过线性判别数值分析，分别将芽孢杆菌属、糖多孢菌属作为白曲、黄曲的生物标志物。大曲中优势细菌群落分布具有趋向性：乳酸杆菌在大曲表层所占比例达55.9%～80.9%；芽孢杆菌则集中在大曲曲心，占24.7%～68.6%[7]。

不同酿造原料中的细菌多样性存在一定规律：窖泥细菌多样性最为丰富、大曲次之、酒醅及黄水中细菌多样性最低[8]。同一轮次不同堆积时期的变化趋势为堆积中期＞堆积后期＞堆积前期[9]，乳酸杆菌属、埃希氏菌属（Escherichia-Shigella）和芽孢杆菌属在堆积发酵过程中占主导地位。窖池发酵前期，糟醅中以酵母菌为主；随着窖池厌氧发酵，乳酸杆菌持续产酸，糟醅pH降低，霉菌及酵母菌被抑制，芽孢杆菌、乳酸杆菌大量繁殖。至窖池发酵后期，细菌多样性已从多菌属共生结构转变呈乳酸杆菌属主导的生态结构[10-11]。

近年来，七个轮次酿造环境及糟醅中微生物群落结构相关研究也多有进展。王琳等[12]研究指出，1轮次酿造环境中细菌菌群与其他轮次之间存在显著差异性，克罗彭斯特菌属、魏斯氏菌属、克罗诺杆菌属（Cronobacter）等16个细菌属是造成各轮次差异的主要细菌种群。WANG L C等[11]对4、5、6、7轮次出窖糟醅细菌多样性进行主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），发现4、5、6、7轮次出窖糟醅细菌多样性趋于一致。4轮次堆积前后糟醅和5轮次堆积前后糟醅的细菌多样性差异较小，5、6轮次差异较大，6、7轮次差异较小。进一步解释了4、5轮次酒质相似，6、7轮次酒质相似的原因。

1.2 酱香型白酒酿造过程中细菌代谢过程及代谢产物

细菌代谢过程中涉及到白酒中多种主要香气成分的生成，如杂醇油、吡嗪类、吡啶类物质等。以乳酸杆菌为代表的细菌主要通过丙酸代谢途径合成并参与苏氨酸代谢途径生成正丙醇[13]。卢建军等[14]进一步证实面包乳杆菌（Lactobacillus panis）代谢生成正丙醇能力最强，产量为263.7 mg/L。徐岩等[15]筛选出高产乙偶姻及四甲基吡嗪的芽孢杆菌，明确了四甲基吡嗪在细菌中的代谢途径；张小龙等[2]比较产香细菌代谢产生的四甲基吡嗪、乙偶姻和2,3-丁二醇的含量关系，佐证了这一观点。WANG P等[16]进一步指出地衣芽孢杆菌与吡嗪含量的相关性。柳习月等[6]通过冗余分析，发现芽孢杆菌、葡萄球菌（Staphylococcus）、糖化酶和四甲基吡嗪之间有很强的相关性。WANG P等[17]认为芽孢杆菌孢子中的2,6-吡啶二甲酸在高温发酵阶段大量积累，并经多轮次发酵转化为各吡啶类化合物，成为茅台酒特征香味物质。郭学武等[18]总结了目前报道中酿造功能细菌及其主要谢产物，如图1所示。

图1 白酒生产中功能细菌主要代谢产物Fig.1 Main metabolites of functional bacteria in Baijiu production

芽孢杆菌除了代谢产生香气物质外，还通过激活酿酒微生态中氨基酸的生物合成，促进其他呈香物质产生。如WU Q等[19]向固态发酵培养基中添加地衣芽孢杆菌，激活了半胱氨酸的生物合成，提升了2,3-丁二醇、3-羟基-2-丁酮、四甲基吡嗪等物质含量。苯丙氨酸代谢可为酱香型白酒提供花果香，产生肉桂酸，对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸等有机酸；苯乙酸、苯乙醇、苯乙醛、香草醛等多种香味物质。高温大曲中苯丙氨酸代谢代谢具有普遍性，芽孢杆菌、克罗彭斯特菌属、片球菌属、糖多孢菌属均可进行苯丙氨酸代谢[11]。HE G Q等[20]进一步指出，芽孢杆菌与苯乙醇和苯乙酸等芳香化合物有较强的正相关关系。酱香型白酒中多种香气物质与微生物的关联性见表2[11]。

表2 酱香型白酒中多种香气物质与微生物的关联性Table 2 Correlation between aroma compounds and microorganisms in sauce-flavor Baijiu

续表

2 酱香型白酒酿造过程中酵母菌多样性及代谢过程研究

2.1 酱香型白酒酿造过程中酵母菌多样性

酵母菌在高温环境无法生存，因此在高温大曲中含量甚微。酵母菌主要分布在糟醅堆积过程及入窖发酵前期。糟醅堆积过程富集了环境中酵母菌及大曲优势菌，在淘汰了部分杂菌的同时为入窖发酵提供微生物动力和酶动力，对各类风味前体物质的形成奠定基础[9，21]。涂昌华等[22]研究了茅台酒厂下沙、糙沙轮次堆积发酵酒醅的微生物多样性及动态变化规律：糟醅堆积初期，微生物以细菌为主；随着堆积进行，酵母菌逐渐成为优势菌株，至入窖前数量可达107～108CFU/g酒醅。

窖池发酵是堆积过程的延续。由于酵母菌对温度敏感，窖池上层糟醅中酵母菌丰度最高、中层其次、下层最低。崔守瑜等[23]对不同轮次下窖糟醅进行检测，发现酵母菌是入窖糟醅的优势菌，数量可达到106～107CFU/g。随着厌氧发酵进行，窖池温度升高，溶氧降低，酵母菌和乳酸菌此消彼长，出窖糟醅中酵母数量均＜10 CFU/g酵母。在7个轮次发酵中，酵母菌整体丰度呈波浪式变化。

不同轮次糟醅中的酵母菌种类和数量差异明显，下沙、糙沙轮次以库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）为绝对优势酵母菌；随着轮次递增，酒醅中优势酵母菌的种类增多，主要优势酵母菌有库德里阿兹威毕赤酵母、满洲毕赤酵母（Pichia manshurica）、拜尔接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和念珠酵母（Candida apicola）。糟醅中酵母菌多样性在完整发酵周期内呈现先升高再减低的态势，以3轮次糟醅中的酵母菌最为丰富[24]。

2.2 酱香型白酒酿造过程中酵母菌代谢过程

酵母菌对产酒率及香味组分形成具有重要作用。卢君等[25]向4轮次糟醅中外源添加耐酸酿酒酵母NJ2和粟酒裂殖酵母LJ3，发现出窖糟醅基酒产量提高了13.47%～25.97%，且其他风味指标没有明显差异。王晓丹等[26]将德巴利酵母（Debaryomyces coudertii）FBKL2.0130和FBKL2.0310添加到糙沙轮次堆积糟醅中模拟窖池发酵，出窖糟醅中多元醇含量分别增加1.418 mg/g和1.461 mg/g。周钰涵等[27]将酿酒酵母与球拟酵母混合发酵，发现后者在保持酿酒酵母产乙醇能力的同时提高其产酯能力。刘建学等[28]研究发现戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）和酿酒酵母共发酵时可以提升菌株产酸和产乙醇能力。田源等[13]认为酵母菌主要在糟醅入窖发酵前7 d产正丙醇，酿酒酵母和库德里阿兹威毕赤酵母是正丙醇合成优势菌株，主要通过2-甲基苹果酸代谢途径和苏氨酸代谢途径合成正丙醇。酵母菌代谢产生正丙醇途径如下：

3 酱香型白酒酿造过程中霉菌多样性及代谢过程研究

3.1 酱香型白酒酿造过程中霉菌多样性

长期的酿造环境选择性富集了大量功能霉菌，这些霉菌在敞开式制曲、堆积过程中进入酿造体系并发挥作用。因为不同酿造环境霉菌多样性不同，不同厂区霉菌种类及数目也存在差异[29]。霉菌生长喜湿喜热，在高温大曲发酵中前期出现频率较高，并在培曲中前期达到顶峰[30]。霉菌作为高温大曲的主要真菌，其丰度低于细菌，高于酵母菌。夏玙等[31]研究发现，根毛霉属（rhizomucor）、曲霉菌属（Aspergillus）等霉菌是大曲中的优势真菌类群。朱治宇等[32]进一步明确了黄曲霉、丝衣霉（Byssochlamys）、红曲霉（Monascus）等6种霉菌属是高温大曲中的优势霉菌；链格孢霉（Alternaria）、黄曲霉、丝衣霉等13种霉菌属是酱香白酒酿造环境中的优势霉菌。

堆积过程中霉菌整体呈显著下降趋势，优势菌株有曲霉、丝衣霉、被孢霉（Mortierella）等[33-34]：堆积初期，霉菌数量比酵母菌高1～2个数量级，随着堆积时间延长，除堆下位置霉菌略有增长外，其余各堆点都呈现下降趋势，堆心下降尤为明显。

窖内发酵是堆积发酵的延续，优势霉菌主要为青霉菌和曲霉菌。窖池内氧气含量自上到下呈梯度减少，而霉菌又属于好氧微生物，因此，入窖后霉菌数量也呈现梯度分布：上层＞中层＞下层[23]。张元洪[35]总结了南北方不同品牌酱香型白酒入窖发酵过程中霉菌变化规律，发酵开始后霉菌数量急剧下降，发酵至第7天霉菌数量短暂回升，发酵后期菌体数量再次呈现出减少态势，直至发酵结束。不同霉菌在窖池发酵过程中消长规律不尽相同：窖内发酵酒醅的优势霉菌为青霉菌属和曲霉属[36]，随发酵进行数量逐渐减少，发酵中后期又有所回升，直至发酵结束所占比例再下降；红曲霉则随着发酵进行数量逐渐增加；枝孢属霉菌（Cladosporium）则是发酵前期的优势菌株，随发酵进行不断降低，直至无法检出。

3.2 酱香型白酒酿造过程中霉菌代谢过程

霉菌作为大曲、糟醅发酵的主要糖化动力源，能够分泌糖化酶、液化酶、纤维素酶、蛋白酶、酯化酶、脂肪酶、果胶酶、漆酶等重要酶类，对原料中淀粉、蛋白质等的降解具有重要催化作用。原料经酶解后生成糖类及氨基酸，供其他微生物生长代谢利用，进而为酱酒风味物质的产生提供基础[35]。不同种类霉菌产酶种类和酶活差异较大[37]：曲霉主要产糖化酶、蛋白酶、果胶酶等；毛霉主要产糖化酶和蛋白酶；根霉主要产糖化酶；青霉主要产脂肪酶和果胶酶。

常吕珍等[38]选取的黑曲霉F5代谢产生糖化酶，可以将酿酒酵母产乙醇能力提高至32.2%。鲁珍等[39]从高温大曲中筛选出一株高产酶的黑曲霉，固态发酵后可产36.85%的酚类、9.29%的醇类和5.86%的呋喃类物质，其中2-甲氧基苯酚、4-乙烯基愈创木酚含量最高为17.21%、14.88%。王晓丹等[40]从高温大曲中分离出一株姆斯特丹散囊菌（Eurotium cristatus）。该菌株高产糖化淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、脂肪酶与纤维素酶，其固态发酵代谢产物以高级醇、酮和呋喃类为主，有很强的花香和水果香，同时有菜香、草香和木香，对酱香型白酒的风味形成具有贡献。

4 酱香型白酒酿造过程中放线菌多样性及代谢过程研究

4.1 酱香型白酒酿造过程中放线菌多样性

放线菌代谢产物对酿酒功能微生物有代谢调控作用，进而影响香气物质产生。作为细菌的一个分支，放线菌较难通过传统纯培养方法分离，因此研究相对较少。近年来随着高通量测序等检测技术的发展，功能放线菌研究才逐渐深入。从酱香型白酒酿造过程中分离出的放线菌以高温放线菌科为主，具体科属如表3[41]所示。

表3 酱香型白酒酿造过程中主要放线菌属Table 3 Main Actinomycetes during the fermentation of sauce-flavor Baijiu

酿造过程中放线菌主要源于土壤，因此窖泥中放线菌含量最高，大曲中次之，酒醅中含量最低。王晓丹等[42]对高温大曲进行高通量分析，发现大曲中高温放线菌属是优势菌，含量最高达66.10%；程才璎等[9]通过聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electro-phoresis，PCR-DGGE）检测，发现高温放线菌属是大曲和堆积酒醅中共有的优势菌群之一；黄蕴利等[43]对糟醅进行高通量分析，发现堆积酒醅中仅存在1.37%的高温放线菌属。

4.2 酱香型白酒酿造过程中放线菌代谢过程

放线菌代谢产物对酒体呈味物质的影响源自两方面。一方面，放线菌本身代谢产生或降解呈味物质：罗小叶等[44]筛选的3株放线菌代谢产物中酯类物质含量分别占62.80%、59.23%和46.77%，并且可以产生吡嗪类、少量酮类、醛类、酚类等物质；酒体土腥味、土霉味产生的直接原因—土霉素，则是由链霉菌代谢产生[45]。罗青春等[46]从窖泥中筛选出一株原玻璃蝇节杆菌（Arthrobacter protophormiae），对正丙醇降解率可达91.2%。

另一方面，放线菌代谢产物对其他产香微生物有促进或抑制作用，进而控制香气产物的代谢生成。施思等[47]将链霉菌代谢产物分别添加至细菌种子液、酵母菌种子液中进行固态发酵。通过代谢通路分析，放线菌对芽孢杆菌的主要调控代谢路径有丙酮酸代谢、硫代谢、糖酵解途径；对酵母菌的主要调控代谢路径有淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢和苯丙氨酸代谢，从而促进苯乙醛还原苯乙醇及苯乙醇酯化生成乙酸苯乙酯。链霉菌分泌的七烯大环内酯类抗生素及盐霉素会对酿造微生物产生拮抗作用：DU H等[48]发现土臭素产生菌—桑普索尼链霉菌QC-2会显著抑制酿酒酵母和霉菌生长，且成熟期菌株对酵母抑制作用最明显。其通过抑制酵母菌中3-辛醇、3-甲基丁醇、辛酸乙酯和癸酸乙酯的产生，最终导致酵母香气物质产生量降低；尤小龙等[49]筛选的白色链霉菌S5对地衣芽孢杆菌存在显著抑制；ZHI Y等[50]筛选出的枯草芽孢杆菌2-16和解淀粉芽孢杆菌1-45则可以显著抑制57.8%和84.3%桑普索尼氏酵母菌的生长。

放线菌除了影响呈味物质外，还通过产酶来调节酿酒微生态。王芙蓉[51]从高温大曲中分离出一株普通高温放线菌（Thermoactinomyces vulgaris），淀粉酶活力可达815.54 U/g烘干大曲；分离自高温大曲的可可链霉菌（Streptomyces cacaoi）和沙阿霉素链霉菌（Streptomyces zaomyceticus）产果胶酶能力突出，最高可达299.66 U/g[44]；白成松等[52]从酒糟中筛选出一株产色高温单孢菌（Thermomonospora chromogena），该菌株产淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶能力均较强。

5 展望

从高温制曲、高温堆积再到窖池发酵，酱香型白酒酿造过程存在着“多菌共酵”的固态发酵形式。当前酿酒功能微生物相关研究多针对于单一或少数几种菌株，而对酿造微生物群落动态变化及其代谢过程变化规律有待深入研究。了解酿酒功能微生物作用机理，对解析酱酒香气组分来源，提升酒质意义重大。随着分析检测技术的进步，国内外学者更多从分子生物学、生物信息学、多组学联用等角度开展酿酒功能微生物演替规律研究，这有利于进一步揭开酱香白酒特征风味物质与微生物动态变化规律及其代谢产物之间关联的神秘面纱。