基于UHPLC-Q-TOF/MSE技术分析武夷岩茶的化学成分

韩沙沙，郑伟，南易，殷祥昶，张洁，陈晓娟，季守平，马百平*

（1.天津中医药大学研究生院，天津 300193）（2.军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所，北京 100850） （3.泉州师范学院海洋与食品学院，福建泉州 362000）

茶（Camellia sinensis）有上千年的历史，是世界上最古老和最受欢迎的饮料之一[1]，广泛分布在中国、印度、斯里兰卡和肯尼亚等国家[2]。茶中含有丰富的茶多酚、茶多糖、游离氨基酸、维生素及矿物质等营养物质，具有一定的抗氧化、抗炎、免疫调节、抗癌、心血管保护、抗糖尿病、抗肥胖、降血糖、肝保护等保健功效[3-5]。根据加工方式和品质特征，茶可分为绿茶、白茶、黄茶、乌龙茶、红茶和黑茶六大类[6,7]。

武夷岩茶具有“岩骨花香”的品质特征，是独特的风味和香气的综合表现，属于半发酵的乌龙茶，具有“中国十大名茶之一”的称号[8]，产自福建闽北“秀甲东南”武夷山一带，茶树生长在岩缝之中[9,10]。其主栽品种为水仙和肉桂[2]，前者注册为国家茶叶品种，产量高，后者注册为省级茶叶品种，不同品种武夷岩茶的品质风味具有显著差异[11,12]，因此，分析代表性品种的化学成分及研究与品质相关的品种差异性具有重要意义。

近年来，越来越多的研究关注于不同品种影响武夷岩茶滋味品质的原理，已有研究表明，不同品种的武夷岩茶鲜茶叶之间非挥发性成分含量分布存在显著差异，主要差异性成分为儿茶素类和黄酮醇苷类成分[2,13]。但是，目前进行的研究主要集中于测定茶多酚、生物碱等特定化学成分的含量[14,15]，对整体化学成分特征进行比较分析的研究较少，且尚未有针对水仙和肉桂成品茶中非挥发性成分差异性的研究[13]。本研究采用UHPLC-Q-TOF/MSE技术结合PCA及OPLS-DA的方法对水仙和肉桂的非挥发性成分进行整体检测分析，探究两种名优武夷岩茶之间的差异并寻找潜在差异标志物，以期为武夷岩茶的深入开发应用、质量控制及品种判别提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水仙和肉桂样品来自A、B、C三个厂家，共12个水仙样品和11个肉桂样品，详见表1。

表1 武夷岩茶样品信息汇总 Table 1 Summary of Wuyi rock tea sample information

乙腈（色谱级），Fisher美国；甲酸（质谱级，纯度≥99%），上海麦克林生化科技有限公司；屈臣氏蒸馏水，广州屈臣氏蒸馏水有限公司。其他试剂均为市售分析纯。对照品：没食子酸（Gallic acid）、儿茶素（Catechin，C），表儿茶素（Epicatechin，EC）、儿茶素没食子酸酯（Catechingallate，CG）、表儿茶素没食子酸酯（Epicatechingallate，ECG）、没食子儿茶素（Gallocatechin，GC）、表没食子儿茶素（Epigallocatechin，EGC）、没食子儿茶素没食子酸酯（Gallocatechingallate，GCG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）、茶碱（Theophylline）、茶黄素（Theaflavin）、茶黄素-3-没食子酸酯（Theaflavin-3-gallate）、茶黄素-3’-没食子酸酯（Theaflavin-3’-gallate）、茶黄素-3,3’-双没食子酸酯（Theaflavin-3,3’-digallate）、茶氨酸（Theanine）、木犀草素（Luteolin）、山柰酚（Kaempferol）、原花青素B2（Procyanidin B2），纯度均大于98%；原花青素B1（Procyanidin B1），纯度大于97%，均购自成都普瑞法科技开发有限公司。杨梅素（Myricetin，纯度≥98%），Sigma。咖啡碱（Caffeine）为本实验室自制，HPLC面积归一化法测定纯度大于98%。

1.2 仪器与设备

Waters ACQUITY I-Class超高效液相色谱系统，Waters公司，Milford，MA，美国；VION-IMS- Q-TOF质谱系统，Waters公司，Wilmslow，英国；UNIFI 1.9.4软件；Waters ACQUITYTMHSS T3 C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），Waters，爱尔兰；Sartorius BP211D 1/10万电子天平，美国Sartorius公司；舒美KQ-600E数控超声波清洗器，江苏昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备

为了区分茶叶中的同分异构体，将混合对照品溶液制备为a和b。a：称取没食子酸、C、CG、GC、GCG、茶碱、咖啡碱、茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3,3’-双没食子酸酯、茶氨酸、木犀草素、杨梅素、原花青素B2各0.3 mg，分别加入75%（V/V）乙醇1 mL溶解，摇匀，制得各对照品储蓄液，再分别取各对照品储蓄液100 μL，混匀即得。b：称取EC、ECG、EGC、EGCG、茶黄素-3’-没食子酸酯、山柰酚、原花青素B1各0.3 mg，分别加入75%（V/V）乙醇1 mL溶解，摇匀，制得各对照品储蓄液，再分别取各对照品储蓄液100 μL，混匀即得。

1.3.2 供试品溶液的制备

分别称取各武夷岩茶粉末0.2 g（过40目筛），精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入75%（V/V）乙醇溶液10 mL，密塞，摇匀，称重，超声处理30 min，冷却至室温，用75%（V/V）乙醇补足失重，摇匀，0.22 μm针式过滤器滤过，取续滤液，即得。

取各茶叶样品续滤液200 μL置于具塞锥形瓶中作为质量控制样品（Quality Control，QC），在UHPLC-Q-TOF/MSE分析过程中，每6个样品中插入QC样品，以确定检测结果的准确性。

1.3.3 UHPLC-Q-TOF/MSE分析

超高效液相色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITYTMHSS T3 C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱（0～1 min，2% B；1～2 min，2%～4% B；2～4 min，4%～7% B；4～8 min，7%～12% B；8～10 min，12% B；10～14 min，12%～13.5% B；14～20 min，13.5%～37.5% B；20～22 min，37.5%～60% B；22～23 min，60%～61.5% B；23～26 min，61.5%～76.5% B；26～27 min，76.5%～95% B；流速：0.5 mL/min；柱温45 ℃；进样量1 μL。

飞行时间质谱条件：电喷雾电离离子源（ESI），离子化模式为正、负离子模式，离子源温度为110 ℃，脱溶剂气体为氮气，流速为850 L/h，温度为450 ℃。正离子模式下毛细管电压为3 kV，低能量扫描时能量为6 eV，高能量扫描时能量为35～55 eV。负离子模式下毛细管电压为2.5 kV，锥孔电压为50 V，低能量扫描时能量为6 eV，高能量扫描时能量为30～50 eV。扫描范围为100～1500 u。准确质量数用Leucineenk ephalin作校正液。

1.4 数据处理

1.4.1 UNIFI数据库及分析方法的建立

应用UNIFI 1.9.4软件的数据库管理系统，查阅相关文献建立茶叶化学成分数据库（349个化合物），包括化合物名称、分子式、化学结构式和碎片离子信息等，并导入UNIFI软件中。分析方法中设定加合离子峰的种类（负离子模式为[M-H]-、[M+HCOO]-，正离子模式为[M+H]+、[M+Na]+、[M+H-H2O]+)。

1.4.2 定性分析

建立UHPLC-Q-TOF/MSE方法用于表征武夷岩茶中化学成分，并结合UNIFI数据分析平台，根据精确分子量，碎片信息和化合物的保留时间等对武夷岩茶中化学成分进行在线鉴定，得到初步分析结果，利用筛选方法进一步处理（设定质量误差-5～5 Mu，响应值＞2000），将UNIFI筛选后的化合物与对照品的裂解规律进行核对，并参考相关文献，完成各化学成分的人工识别和定性分析。具体鉴定步骤如图1所示。

1.4.3 多元统计学分析

利用Umetrics Ezinfo 3.0软件（Waters公司，Manchester，英国）对所有水仙与肉桂样品在0～27 min内的UHPLC-Q-TOF/MSE指纹图谱进行PCA分析和OPLS-DA分析，两者差异性成分的筛选条件：变量重要性投影（Variable Important In Projection，VIP）＞7.0（通常认为VIP＞1.0的变量对模型有意义，VIP越大，变量的贡献率越大。为得到差异更加显著的成分，比较了多个VIP筛选得到的结果，最终选择以VIP＞7.0为筛选条件）。通过参考UNIFI数据库，对照品以及相关文献对筛选出的成分进行鉴定，再利用Origin 2019b软件（OriginLab公司，美国）对筛选后的成分进行热图绘制。

2 结果与分析

2.1 武夷岩茶化学成分的鉴定

采用已建立的UHPLC-Q-TOF/MSE方法快速分析武夷岩茶样品，负、正离子模式下QC样品的基峰强度离子流图（Base Peak Ion Chromatogram，BPI Chromatogram），见图2。

通过UNIFI结合茶叶数据库处理后得到相应化合物的保留时间、化学式、质量数误差、标识的高能量碎片数目等信息，并与对照品及相关文献[13,16-27]进行对照和确证，鉴定了武夷岩茶中104个化合物，其中包括16个儿茶素、40个黄酮醇及黄酮苷、9个原花青素类、2个水解单宁类、13个酚酸、8个茶色素、14个生物碱、1个氨基酸、1个脂质类成分。鉴定结果详见表2。

2.1.1 武夷岩茶中化学成分的质谱裂解途径

武夷岩茶中富含茶多酚类成分，其主要种类是儿茶素、黄酮醇、酚酸和原花青素[28]。利用UHPLC-Q-TOF/MSE技术结合UNIFI数据分析平台可以表征出武夷岩茶中茶多酚类成分，且其中多为儿茶素和黄酮醇及黄酮苷类成分。

儿茶素类化合物在质谱条件下容易脱去中性碎片CO、CO2、H2O及C2H2O等，例如色谱峰23，在负离子模式下，存在m/z289.0719 [M-H]-的准分子离子峰，负离子高能量时依次出现碎片离子m/z245.1229 [M-H-CO2]-、227.1127 [M-H-CO2-H2O]-、205.0943 [M-H-2(C2H2O)]-、203.1143 [M-H-CO2-C2H2O]-、179.0347 [M-H-C6H6O2]-（丢失B环）、165.0188 [M-H-C7H8O2]-（C环1，2键断裂）、137.0699 [M-H-C8H8O3]-（C环1，3键断裂），125.0248 [M-H-C9H8O3]-（C环1，4键断裂）。化合物的二级质谱裂解碎片，与对照品及参考文献[29]一致，鉴定该化合物为EC。裂解途径见图3。

黄酮苷类化合物在质谱条件下多以糖苷键断裂为主，例如色谱峰86。在负离子模式下，色谱峰86存在m/z1049.2749 [M-H]-的准分子离子峰，负离子高能量时依次出现碎片离子m/z917.2296 [M-H-Ara]-、301.0351 [M-H-Ara-Glc-Rha-Glc-(p-coumaroyl)]-。在正离子模式下，色谱峰86存在m/z1051.2891 [M+H]+的准分子离子峰，正离子高能量时出现碎片离子m/z303.0494 [M+H-Ara-Glc-Rha-Glc-(p-coumaroyl)]+。化合物的二级质谱裂解碎片，与参考文献[18,20,23]一致，鉴定该化合物为槲皮素-3-O-葡萄糖基-鼠李糖基-(对香豆酰基-阿拉伯糖基)葡萄糖苷。见图4。

此外，对于含有葡萄糖基或半乳糖基的黄酮醇苷异构体，在反相液相色谱分离中，一般含半乳糖基的黄酮醇苷的色谱保留时间小于含葡萄糖基的黄酮醇苷的色谱保留时间[16]，例如色谱峰38（杨梅素-3-O-半乳糖苷）和色谱峰40（杨梅素-3-O-葡萄糖苷）。

2.2 水仙和肉桂的成分差异性

2.2.1 PCA

PCA是一种通过降维将多个变量转化成一组新的互相无关的几个综合变量，使其中每个新的变量能够反映出原始变量信息的统计方法，是一种无监督的统计学方法[30]。由于正离子模式表征的大多数化合物响应强度较低，不具有代表性，因此对负离子模式下0～27 min的指纹图谱数据进行PCA分析，如图5所示，武夷岩茶的QC样品聚类较好，说明液质分析方法的稳定性良好；水仙和肉桂在PCA图上存在明显的分布差异，水仙位于第1主成分的负轴，肉桂位于第1主成分的正轴，即水仙和肉桂在化学成分上有明显差异。

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2.2.2 OPLS-DA

OPLS-DA是一种有监督的模式识别方法，可以强化组间差异。为充分了解水仙与肉桂的显著差异性成分，对实验数据进一步进行OPLS-DA分析。如图6所示，水仙与肉桂分类明显，与PCA结果一致，且组内聚类效果较好，可以看出OPLS-DA模型分类效果更为显著。

通过VIP＞7.0进行差异性成分的筛选（图7），结合UNIFI数据库、对照品和相关文献，鉴定出水仙与肉桂之间的19个差异性成分，其中包含7个儿茶素、9个黄酮醇苷、1个酚酸、2个茶色素。差异性成分信息详见表3。水仙和肉桂在负离子模式下的色谱图中差异性成分色谱峰的指认如图9所示。

2.2.3 差异性成分的相对含量分析

基于19个差异性成分的峰面积归一化值，利用Origin 2019b软件进行聚类热图分析，归一化值对应左侧的颜色刻度条，与差异性成分的相对含量成正比。从图9中可以看出，水仙样品中相对含量较高的差异性成分：儿茶素类、酰化黄酮醇苷类、茶色素类；肉桂样品中相对含量较高的差异性成分：酚酸类、甲基儿茶素类、杨梅素糖苷类、山柰酚糖苷类。聚类热图显示水仙样品主要分为3类，分别是①武夷山吴三地的水仙样品（A厂家）；②武夷山星村镇黄村（A厂家）、武夷山天心岩和桂林的水仙样品（C厂家）；③永春县湖阳镇白云村的水仙样品（B厂家）。肉桂样品主要分为2类，分别是①武夷山星村镇黄村的肉桂样品（A厂家）；②武夷山天心岩和桂林的肉桂样品（C厂家）。

3 结论

3.1 采用UHPLC-Q-TOF/MSE对武夷岩茶进行快速、全面的定性分析，基本上实现了对主要非挥发性成分的鉴定，涵盖了液质指纹图谱中的大多数色谱峰。通过PCA、OPLS-DA和聚类热图对不同武夷岩茶的液质指纹图谱进行分析评价，建立区分和鉴别水仙、肉桂成品茶的OPLS-DA模型，并鉴定两者之间19个主要差异成分，其中水仙样品中儿茶素、酰化黄酮醇苷、茶色素相对含量较高，肉桂样品中酚酸、甲基儿茶素、杨梅素糖苷、山柰酚糖苷的相对含量较高。

3.2 本研究明确了武夷岩茶的非挥发性化学成分组成，为武夷岩茶的品质、药理活性研究以及深度开发奠定了基础；并且明确了了武夷岩茶水仙与肉桂的成分差异性。利用建立的液质指纹图谱结合多元统计方法就可以客观区分、鉴别水仙和肉桂。

3.3 据报道，武夷岩茶的化学成分和品质受地理位置[31-33]、采摘时节[34]、加工方法、储藏年份[35]等因素综合影响，本实验所用武夷岩茶样品的品种、厂家和储藏年份不同，但实验结果仍可明确区分水仙和肉桂，表明品种因素对武夷岩茶中化学成分的影响最大。年份等因素对武夷岩茶中化学成分的影响尚待进一步深入研究。

致谢

本论文的武夷岩茶样品来自于武夷山南湖生态茶业、回应生态茶业、泉州华友茶业；感谢舒放先生对本实验的指导和帮助。