L-半胱氨酸盐酸盐对曲奇中4种有害醛类形成的抑制作用及其品质的改善效果

刘百里，郑洁，黄才欢，刘付，欧仕益

（暨南大学理工学院，焙烤食品安全粤港联合创新平台，广东广州 510632）

曲奇是全世界最受欢迎的烘焙产品之一[1]。它们含有大量糖、蛋白质和脂质，并经过高温烘烤处理，因此曲奇是研究美拉德反应衍生的化学危害的典型模型。以往研究焙烤加工食品的有害物方面多专注于丙烯酰胺问题[2]。然而，在美拉德反应或糖类的直接热裂解过程中，还会产生5-羟甲基糠醛（HMF）、α-二羰基化合物如3-脱氧葡萄糖醛酮（3-DG）、乙二醛（GO）、丙酮醛（MGO）等[3]。此外，脂质氧化也会产生GO、MGO等α-二羰基化合物[4]。研究表明，HMF可生物转化为5-亚砜甲基-2-糠醛（SMF），后者能够与DNA发生反应且具有潜在致癌性[5]。二羰基化合物与蛋白质反应形成晚期糖基化终末产物（AGEs），AGEs与多种和年龄相关的慢性炎症疾病的发展相关，例如糖尿病、心血管疾病[6]、癌症[7]、中枢神经系统疾病[8]。在分子水平上，羟基酪醇可以有效捕获乙二醛和丙酮醛，它们与3-脱氧葡萄糖醛酮一起，代表了食物中最丰富的二羰基化合物[9]。L-半胱氨酸由发酵法制得，我国年产约1×104t[10]。它是一种还原剂，能切断蛋白质分子内的二硫键进而弱化蛋白质的结构，使蛋白质伸展开。L-半胱氨酸在食品、化妆品和医药保健品中有广泛用途，其中食品添加剂用途占比60%以上。同时，L-半胱氨酸还具有抗氧化应激、改善人体脂质代谢和益生元等作用[11]。

根据课题组前期研究，在生理条件下半胱氨酸可以与3-DG、GO、MGO、HMF形成加合物并降低细胞毒性，如丙烯醛的毒性降低近60倍[12,13]。因L-半胱氨酸溶解度小，食品工业中都用其盐酸盐；L-半胱氨酸盐酸盐是面粉改良剂，但在曲奇中的使用剂量，能否显著降低以上四种有害醛类还未知。因此，本研究通过将不同添加量的L-半胱氨酸盐酸盐加于曲奇中，研究对曲奇外观品质、4种有害醛类含量及细胞毒性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

低筋小麦粉，益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司；酥油、烤焙油，天津南侨食品有限公司；二甲基亚砜、氯化钠、蔗糖、碳酸氢钠，均为分析纯，天津大茂有限公司；2,4-二硝基苯肼、邻苯二胺、甲醇，德国默克试剂有限公司；5-羟甲基糠醛（98%），北京百灵威科技有限公司；乙二醛、丙酮醛，质量分数40%水溶液，北京百灵威科技有限公司；3-脱氧葡萄糖醛酮，加拿大TRC有限公司；L-半胱氨酸盐酸盐（99%），北京梦怡美生物科技有限公司；MTT，德国BIOFROX公司。

1.2 仪器与设备

LC-20AT高效液相色谱、GCMS-QP2010 ULTRA气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司；Centrifuge 5810 R离心机，德国Eppendorf公司；XW-80A型微型旋涡混合仪，上海沪西分析仪器厂；SPECTRONIC-200分光光度计，赛默飞；QTS质构仪，英国Stable.Micro System公司。

1.3 实验方法

1.3.1 曲奇的制备

参照美国AACC 10-54[14]方法制作曲奇。曲奇配方如表1（原料小麦粉不含有L-半胱氨酸盐酸盐）所示，首先将酥油迅速搅拌，加入蔗糖、奶粉、盐、小苏打搅打；之后取高果糖浆、碳酸氢铵、水，混合再向其中添加L-半胱氨酸盐酸盐（L-半胱氨酸盐酸盐添加量为0.0、0.3、0.6、1.0、1.5 g/kg）制得混合溶液。将溶液与干粉料搅拌均匀，置于心型模具内制成曲奇，放在预热45 min后的烤箱中，于200 ℃下烘焙15 min制得曲奇。

表1 曲奇配料 Table 1 Cookie ingredients (g)

1.3.2 感官评价

构建感官评价小组，小组有12名成员（3名男性和9名女性，年龄21至24岁）。对曲奇样品进行评价，分别从颜色、形态、香味、甜味、细腻度、裹齿感、后味七个特性分析。每种特性分数构成为：颜色0～20分，形态0～15分，香味0～15分，甜味0～15分，细腻度0～10分，裹齿感0～10分，后味～15分。

1.3.3 曲奇中挥发性风味物质的测定

根据钟京等[15]的方法稍加改动，采用固相微萃取方法检测曲奇中风味物质。取5 g研磨后的曲奇样品放入40 mL的顶空采样瓶中，于60 ℃恒温条件下吸附萃取30 min。吸附结束后，将萃取头立即插入气相色谱-质谱联用仪进样口，于250 ℃解析3 min，进行分析。色谱条件：DB-5MS色谱柱（300 mm×0.25 mm，0.25 μm）；载气（氦气）流量：恒定流速，0.8 mL/min；升温程序：初温40 ℃，保留3 min，以5 ℃/min升至90 ℃，之后按照12 ℃/min升至220 ℃，保留7 min。

质谱条件：离子源温度200 ℃，电子能量70 eV，电离方式为电子轰击（electron impact），质量扫描范围为30～490。

1.3.4 曲奇白度、质构测定

采用白度计对曲奇样品的色度进行测定，以L*、a*和b*为色度参数。用质构分析仪检测曲奇样品的质构（配备探头TA11/1000和TA90平台），测试速度2 mm/s，触发点负载1 g，返回速度2 mm/s[16]。

1.3.5 曲奇中水提物的制备

将1 g研磨后的曲奇样品置于50 mL离心管中，加入5 mL去离子水，涡旋3 min，在10000 r/min下离心10 min，收集上清液，用5 mL去离子水重复提取两次，合并上清液，用去离子水定容至15 mL。

1.3.6 HMF的测定

将曲奇水提物用0.22 μm滤膜过滤，参照Huang等[17]的方法，进行高效液相色谱分析，色谱柱为Zorbax SB-Aq柱。流动相：5%甲醇水溶液；样品进样体积：10 μL；流速：0.6 mL/min；检测波长：284 nm。通过HMF标准曲线定量。HMF的标准曲线的回归方程为y=101278x-145308（R2=0.9992，线性范围10～600 μg/mL）。每处理重复3次。

1.3.7 MGO、3-DG的测定

对于MGO和3-DG的检测采用OPD衍生法进行高效液相色谱检测，取1.0 mL样品水提物与100 μL 10%（m/V）邻苯二胺甲醇溶液混合后，60 ℃水浴避光衍生24 h。将衍生后的混合物用0.22 μm滤膜过滤，收集滤液采用HPLC测定。混合均匀后在60 ℃水浴中加热60 min，然后取出用0.22 μm滤膜过滤，收集滤液进样分析。根据Ou等[18]的方法，样品分离在Zorbax SB-Aq柱上进行，流动相：A为0.1%乙酸水，B为甲醇，进行梯度洗脱，梯度程序设置：B=28%～43%，0.00～15.00 min；B=43%～75%，15.01～ 30.00 min；B=75%，30.01～35.00 min。流速：0.8 mL/min；进样量：10 μL，柱温：40 ℃，检测波长：314 nm。通过MGO和3-DG的标准曲线进行定量，其中MGO浓度为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2 μmol/mL，3-DG浓度为10、30、50、70、90、120 μg/mL由本实验测得标准曲线回归方程：MGO为y=2128405.56x- 12276.93（R²=0.9996，线性范围0.1～1.2 μmol/mL）3-DG为y=21986.31x+3027.17（R²=0.9999，线性范围10～120 μg/mL）。每处理重复3次。

1.3.8 GO的测定

对于GO的检测采用2,4-二硝基苯肼衍生法[19]进行高效液相色谱检测。取0.2 mL样品水提物加入1.8 mL乙腈和1 mL DNPH（浓度为12.5 mmol/L溶于乙腈/浓盐酸9:1）混合均匀后在70 ℃水浴中加热2 h，冷却后取出用0.22 μm滤膜过滤，收集滤液进样分析。根据Ou等[18]的方法，流动相A为0.1%乙酸水，流动相B为甲醇，进行梯度洗脱，梯度程序设置：

B=28%～43%，0.00～15.00 min；B=43%～75%，15.01～ 30.00 min；B=75%，30.01～35.00 min。进样量：10 μL；流速：0.6 mL/min；柱温：40 ℃。检测波长：435 nm。绘制GO的标准曲线进行定量，其中GO的浓度设置为0.01、0.1、0.2、0.3、0.4 μmol/mL，由本实验测得GO的标准曲线回归方程如下y=3095277.65x-15928.29（R2=0.99，线性范围0.01～0.40 μmol/mL）。每处理重复3次。

1.3.9 细胞活力

通过MTT法检测曲奇水提物对人胃粘膜上皮细胞（GES-1）的毒性，向96孔细胞培养板中加入100 μL 104cells/mL的GES-1细胞单细胞悬液，然后加入100 μL曲奇水提物在37 ℃培养箱中培养24 h，移除培养液，用120 μL含有5 mg/mL MTT溶液的培养基替代药物，37 ℃继续培养4 h后终止培养，移除培养液，每孔加入150 μL DMSO溶液，置于摇床上振荡10 min，然后在570 nm处检测吸光度。每处理重复3次。

1.4 数据分析

实验数据采用Microsoft Excel软件处理，使用平均数±标准差（mean±SD）表示，应用SPSS 25.0软件进行方差分析，并在p=0.05水平下进行Duncan’s显著性差异分析。

2 结果与讨论

2.1 L-半胱氨酸盐酸盐对曲奇感官、色泽和质地的影响

感官评价的结果如表2所示。从颜色、形态、香味、甜味、细腻度、裹齿感、后味七个属性的得分分析，添加L-半胱氨酸盐酸盐后曲奇的感官评价得分高于空白组，当L-半胱氨酸盐酸盐添加量为1.0 g/kg时，曲奇的感官评价得分最高。

表2 L-半胱氨酸盐酸盐对曲奇的感官评分的影响 Table 2 The sensory scores of cookies after adding L-cysteine hydrochloride

曲奇的白度可以通过三个参数来确定，即L*值、a*值和b*值，其中L*值表示黑色（0）/白色（100）颜色，a*值表示绿色（-）/红色（+），b*值表示蓝色（-）/黄色（+）[20]。随着L-半胱氨酸盐酸盐添加量的增大，L*值显著提高，b*值下降，证实了曲奇经L-半胱氨酸盐酸盐处理后会变白。

随着L-半胱氨酸盐酸盐的添加，硬度先升后降。在1.5 g/kg添加量时硬度小于空白组曲奇，咀嚼性显著增加。所以，L-半胱氨酸盐酸盐可对曲奇质构中的硬度和咀嚼性有较大的影响，可使曲奇口感变得更酥脆[21]。

表3 L-半胱氨酸盐酸盐对曲奇质构的影响 Table 3 Effect of L-cysteine hydrochloride on texture in cookies

2.2 L-半胱氨酸盐酸盐对曲奇中二羰基化合物含量的影响

在本实验中，我们研究了L-半胱氨酸盐酸盐对曲奇中3种二羰基化合物（3-DG、GO、MGO）的影响。二羰基化合物3-DG、GO、MGO等化学性质非常活泼，对人体健康产生有害影响，是焙烤食品中需要把控的物质[22]。

由表4可知，L-半胱氨酸盐酸盐的添加可显著降低曲奇中3-DG、GO、MGO的含量。

表4 L-半胱氨酸盐酸盐对曲奇中3-DG、GO、MGO的影响(mg/kg) Table 4 Effect of L-cysteine hydrochloride on 3-DG, GO, and MGO in cookies (mg/kg)

当L-半胱氨酸盐酸盐的添加量为0.3 g/kg时，3-DG含量显著下降，减少了30.05%（p＜0.05），随着添加量继续增大，3-DG、GO、MGO都有显著降低，L-半胱氨酸盐酸盐添加量为1.5 g/kg时，3-DG、GO、MGO含量分别下降了62.73%、46.27%、36.59%（p＜0.05）。以往的研究中，Liu等[23]在热加工模拟体系中添加槲皮素分别降低MGO、GO含量32.60%、40.48%。与此结果相比，L-半胱氨酸盐酸盐效果较好。实验结果表明，L-半胱氨酸盐酸盐对曲奇中产生的二羰基化合物有明显的抑制作用，能有效地降低烘焙过程中产生的有害物。这可能是因为L-半胱氨酸和二羰基化合物形成了加合产物[13]。

2.3 L-半胱氨酸盐酸盐对HMF的影响

研究表明HMF在高浓度下具有细胞毒性，对眼睛、上呼吸道、皮肤和粘膜有刺激性[24]。由表5可知，添加L-半胱氨酸盐酸盐可显著降低曲奇中的HMF含量：当添加量达到0.3 g/kg后，HMF显著下降，降低幅度达到28.75%（p＜0.05）。继续增加L-半胱氨酸盐酸盐的添加量，抑制率显著增加，添加量至1.5 g/kg时，HMF下降82.95%。

表5 L-半胱氨酸盐酸盐对曲奇中HMF的影响 Table 5 Effect of L-cysteine hydrochloride on HMF in cookies

2.4 L-半胱氨酸盐酸盐对曲奇中挥发性风味物质的影响

半胱氨酸可以通过美拉德反应产生肉香、烧烤风味[25]。添加L-半胱氨酸盐酸盐后，曲奇中的挥发性醛、醇和吡嗪含量升高，除呋喃酮外大部分酮类物质含量减少。如表6所示，风味物质含量采用峰面积归一化法计算。吡嗪类物质在对照组中检测到2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪，添加了L-半胱氨酸盐酸盐后增加了2,3-二甲基-吡嗪，2-(正丙基)-吡嗪。其中添加了L-半胱氨酸盐酸盐后2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪含量分别增加了72.51%、92.54%、40%，2,6-二甲基吡嗪含量降低11.18%。醇类物质在对照组中检测到苯甲醇、乙醛缩丙醇苯乙醇、3-呋喃甲醇、1-戊醇、1-辛醇、1,2-丙二醇、3-甲基-4戊烯-1醇、2,3-丁二醇、叶醇，添加L-半胱氨酸盐酸盐后1,2-丙二醇、3-甲基-4戊烯-1醇含量分别降低72.22%、100%，苯甲醇、乙醛缩丙醇苯乙醇、3-呋喃甲醇、叶醇含量分别升高80%、25%、8.15%、4.65%。醛类物质在对照组中检测到乙醛、壬醛、糠醛、2,4-二甲基-苯甲醛、辛烷醛，添加L-半胱氨酸盐酸盐后增加了桃醛、反式-2,4-癸二烯醛、苯甲醛、2-噻吩甲醛。添加了L-半胱氨酸盐酸盐后，壬醛、2,4-二甲基-苯甲醛、辛烷醛含量分别升高85.71%、728.57%、66.67%，乙醛、糠醛含量分别降低88.24%、43.59%。酮类物质在对照组中检测到1-羟基-2-丙酮、3,4-二氢-6-甲基-2H-吡喃-2-酮、5-乙基二氢-2(3H)-呋喃酮、2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、3-甲基-1,2-环戊二酮、1-羟基-2-丁酮、2-庚酮、3-[3-溴苯基]-7-氯-3,4-二氢-10-羟基-1,9(2H,10H)-吖啶二酮、2(5H)-呋喃酮、二氢-5-丙基-2(3H)-呋喃酮、5-丁基二氢-2(3H)-呋喃酮、二氢-5-戊基-2(3H)-呋喃酮、5-己基二氢-2(3H)-呋喃酮，添加前后酮种类基本不变，含量有较明显变化，在添加了L-半胱氨酸盐酸盐后3-[3-溴苯基]-7-氯-3,4-二氢-10-羟基-1,9(2H,10H)-吖啶二酮、2-庚酮、2(5H)-呋喃酮、5-丁基二氢-2(3H)-呋喃酮、二氢-5-戊基-2(3H)-呋喃酮含量分别升高200%、17.24%、7.69%、46.27%、176.14%，1-羟基-2-丙酮、3-甲基-1,2-环戊二酮、1-羟基-2-丁酮、二氢-5-丙基-2(3H)-呋喃酮物质含量分别降低4.75%、61.90%、79.31%、42.67%。这可能是因为半胱氨酸和还原糖的美拉德反应会降低脂肪族羰基的水平源自脂质氧化和降解的化合物，例如酮[26]。含硫化合物-噻吩是肉香味的重要来源[27]。对照组中检测到4-甲基-5-(beta-羟乙基)噻唑，在添加L-半胱氨酸盐酸盐后增加了2-乙基-噻唑、2-乙酰噻唑。

表6 L-半胱氨酸盐酸盐对曲奇中挥发性风味物质的影响 Table 6 Effect of L-cysteine hydrochloride on the volatile flavor substances in cookies

续表6

2.5 L-半胱氨酸盐酸盐对曲奇水提物细胞毒性的影响

采用人胃粘膜细胞（GES-1）研究了曲奇水提物对细胞活力的影响。未加药的对照组细胞存活率为84.8%，添加L-半胱氨酸盐酸盐的曲奇水提物培养GES-1细胞的存活率分别为103.7%、100.9%、86.3%、99.2%。添加了L-半胱氨酸盐酸盐的曲奇水提物培养细胞的存活率均有提高，说明L-半胱氨酸盐酸盐的添加对GES-1细胞活力有促进作用。

3 结论

本实验通过添加不同量L-半胱氨酸盐酸盐，研究对烘焙曲奇外观品质及有害物质的影响。研究表明：L-半胱氨酸盐酸盐提高了曲奇的白度和感官评分，更加酥脆的口感。抑制了曲奇中的活泼羰基化合物（HMF、3-DG、GO、MGO）的形成。同时对风味成分有不同程度的影响，挥发性醛、醇和吡嗪含量升高，除呋喃酮外大部分酮类物质含量减少。添加L-半胱氨酸盐酸盐对细胞没有抑制作用。结合实验数据分析可以得出结论，在1.0 g/kg L-半胱氨酸盐酸盐添加量时，曲奇的外观、气味、口感均令人满意，有害醛类含量较少且对GES-1细胞活力有促进作用。