固态发酵制备辣木叶活性肽及其抗氧化活性

康澳，巩思佳，陈可菁，李子豪，郑雪韵，陈冰冰，陈文浩，曹庸，苗建银*

（1.华南农业大学食品学院，广东省功能食品活性物重点实验室，广东广州 510642）（2.固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川宜宾 644000）（3.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193）

辣木（Moringa Oleifera）是辣木科辣木属多年生热带落叶乔木，在我国的种植面积已达6000 hm2[1]。研究表明，辣木叶干粉的粗蛋白含量达到27.1%[2]，辣木叶中的多糖、多酚等活性成分具有降血糖、抗氧化、降血压等多种保健功效[3]，是优质的天然植物资源。当前，国内的辣木叶除少量作为鲜食蔬菜外，大部分被用作畜禽饲料或废弃物，未被高效利用。

活性氧介导的氧化作用会与脂质、蛋白质反应而导致食品腐败变酸，产生不良异味，因此，抗氧化剂的开发对于食品的加工、保鲜尤为重要。抗氧化剂分为合成抗氧化剂和天然抗氧化剂。目前广泛应用的合成抗氧化剂如没食子酸丙酯、丁羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、特丁基对苯二酚的抗氧化效果显著，但长期食用具有一定副作用[4]，近年来人们更多地把目光投向了天然抗氧化剂的开发[5,6]。抗氧化肽是一类天然的生物活性肽，一般由5～16个氨基酸残基组成，可以通过肽键和羟基提供氢原子或电子来清除缺少氢离子或电子的自由基，或者抑制某些促氧化酶、螯合参与催化自由基生成的过渡金属离子，来抑制超氧化物和自由基形成[7]，达到抗氧化的效果，具有易吸收、稳定性好、保健效果好（降血压、抗衰老）、无免疫反应的优点[8]。目前，抗氧化肽的研究热点是制备工艺的优化、有效组分的分离纯化、抗氧化活性评价及在食品、医药、生物学等领域的应用。本文采用固态发酵法制备辣木叶活性肽，利用筛选出的菌种研究发酵条件与发酵培养基中活性肽含量的相关性并优化出最佳制备工艺，探讨辣木叶肽的抗氧化活性及其氨基酸组成，以期达到安全性高，生产条件温和，可大规模生产辣木叶活性肽的目的，为辣木叶的高值化利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

辣木叶干粉，北部湾滨海富硒功能农业研究院；米曲霉孢子粉（AS 3.951），上海佳民酿造食品有限公司；黑曲霉孢子粉（AS 3.324），上海佳民酿造食品有限公司；葡萄糖，天津市福晨化学试剂厂；三氯乙酸，上海凌峰化学试剂有限公司；酪蛋白，上海生工生物工程技术服务有限公司；无水碳酸钠，天津市大茂化学试剂厂；福林酚，上海源叶生物科技有限公司；磷酸氢二钠，天津市大茂化学试剂厂；磷酸二氢钠，广州化学试剂厂；L-酪氨酸，上海伯奥生物科技有限公司；硫酸铜，天津市大茂化学试剂厂；酒石酸钾钠，天津市福晨化学试剂厂；过硫酸钾，天津市百世化工有限公司；硫酸亚铁，天津市福晨化学试剂厂；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），上海源叶生物科技有限公司；2,2-气联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS），广州市齐云生物技术有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

pH计，上海佑科仪器有限公司；电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；EnSpire™多功能酶标仪，PerkinElmer公司；L530-cence台式低速自动平衡离心机，长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；天津泰斯特电热恒温培养箱DH5000BII，天津泰斯特仪器有限公司；其林贝尔Kylin-bell微型振荡器MH-2型，其林贝尔Kylin-bell；立式压力蒸汽灭菌器，上海云泰仪器仪表有限公司；苏州净化SWCJ1G型无菌操作工作台，苏州净化工程有限公司；生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；HZS-H水浴振荡器，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 辣木叶活性肽制备工艺流程

发酵培养基→高压蒸汽灭菌→无菌接种→固态发酵→分析测定

1.2.2 固态发酵

1.2.2.1 固体培养基的配制

取15 g的辣木叶干粉、加入1.5 g葡萄糖、60颗玻璃珠，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，冷却后待接种。

1.2.2.2 接种培养基

参考Mazumdar[9]的方法并稍作修改。无菌条件下加入一定量的孢子粉、用无菌水调节固体培养基的相对湿度，并调至一定的起始pH值，放入30 ℃恒温培养箱中发酵一定时间后，于121 ℃灭酶10 min。

1.2.3 酶活力测定

参照标准QB/T 1803-1993《工业酶制剂通用实验方法测定中性蛋白酶酶活力》[10]。

以吸光值（OD值）为纵坐标，酪氨酸的浓度（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线（图1），得到回归方程y=0.009x+0.0223，R2=0.9956。

1.2.4 活性肽的提取与测定

参考Parvin[11]的方法并稍作修改。将发酵结束的培养基中加入100 mL蒸馏水，捣碎后于25 ℃、200 r/min条件下水浴振荡2 h，4000 r/min条件下离心30 min，上清液即为样品溶液。

取2.5 mL样品溶液，加入2.5 mL的10%三氯乙酸水溶液，混匀后静置10 min，在4000 r/min条件下离心20 min后，将上清液全部转移到50 mL容量瓶中并用5%的三氯乙酸液定容。吸取6.0 mL溶液至试管，加入双缩脲试剂4.0 mL，混合均匀后静置10 min，在2000 r/min条件下离心10 min后，取上清液于540 nm处测定吸光度值。参考张红波等[12]的研究方法，以OD540nm表示辣木叶活性肽含量。

1.2.5 固态发酵菌种选择

无菌条件下加入10%的孢子粉、用无菌水调节辣木叶粉的湿度为60%，起始pH为6.6（黑曲霉5.6），放入30 ℃培养箱中发酵72 h，发酵结束后于121 ℃灭酶10 min，分析测定选出最优菌种。

1.2.6 固态发酵条件优化

1.2.6.1 单因素实验

以OD540nm为指标，选择含水量、接种量、起始pH值、发酵时间四个因素进行单因素实验，以确定固态发酵最佳工艺条件，具体实验内容如下。

发酵时间：无菌条件下加入10%的孢子粉、用无菌水调节辣木叶粉的湿度为60%，起始pH为6.6，放入30 ℃培养箱中发酵24、48、72、96、120 h，发酵结束后于121 ℃灭酶10 min。

含水量：无菌条件下加入10%的孢子粉、用无菌水调节辣木叶粉的湿度为40%、50%、60%、70%、80%，起始pH为6.6，放入30 ℃培养箱中发酵72 h，发酵结束后于121 ℃灭酶10 min。

起始pH值：无菌条件下加入10%的孢子粉、用无菌水调节辣木叶粉的湿度为60%，起始pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，放入30 ℃培养箱中发酵72 h，发酵结束后于121 ℃灭酶10 min。

接种量：无菌条件下加入3%、5%、8%、11%、14%、17%的孢子粉，用无菌水调节辣木叶粉的湿度为60%，起始pH为6.6，放入30 ℃培养箱中发酵72 h，发酵结束后于121 ℃灭酶10 min。

1.2.6.2 响应面实验

根据单因素结果，结合Box-Behnken中心组合设计原理，以发酵时间、含水量、接种量为自变量，以OD540nm为响应值，设计三因素三水平共17个试验点的响应面实验。每组实验进行3个平行实验，其中5个实验为零点，用于估算误差，12个为析因点。

1.2.7 氨基酸组成分析

总氨基酸含量利用自动分析仪检测，参照食品安全国家标准GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的测定方法》[13]。

1.2.8 活性肽体外抗氧化活性测定

1.2.8.1 DPPH自由基清除能力

实验以Asghar等[14]的实验作为基础，并进行一定程度的变动：用蒸馏水将辣木叶蛋白发酵物的冻干粉配制成0.1、0.25、0.5、1、2 mg/mL的样品液，用85%的乙醇配制成0.1 mmol/L DPPH溶液；样品组：取100 μL不同浓度样液，分别加入100 μL DPPH试剂，充分混匀后于室温静置30 min，此过程要避免与光线直接接触。静置结束后用震荡仪震荡约2 min后，用酶标仪检测吸光度A1，检测波长为517 nm；空白组：与样品组基本一致，其中的DPPH试剂换用质量分数为85%的乙醇试剂即可，用酶标仪检测吸光度A2；对照组：与样品组基本一致，其中的样品换用蒸馏水即可，用酶标仪检测吸光度A0；每个样品进行三次平行试验，将所得的三组数据求平均值用于结果计算：

式中：

A1——样品组的吸光度值；

A2——空白组的吸光度值；

A0——对照组的吸光度值。

样品浓度设置为0.1、0.25、0.5、1、2 mg/mL，得出结果后，根据结果显示的回归方程进行EC50值的计算。

1.2.8.2 ABTS自由基清除能力

实验以Olszowy-Tomczyk等[15]的实验作为基础，并进行一定程度的变动：将ABTS与过硫酸钾分别配制成浓度为7 mmol/L与2.45 mmol/L的溶液，将两者充分混匀，于室温下静置12～16 h，此过程注意避免与光线直接接触，用蒸馏水稀释至样品于734 nm处吸光值为0.70±0.02，得到工作液。样品组：100 μL浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/mL的样品液，加入100 μL工作液，震荡1～2 min混合均匀后于37 ℃下放置10 min，用酶标仪在734 nm下测定吸光值A1；空白组：与样品组基本一致，其中的ABTS换用100 μL蒸馏水即可，用酶标仪检测吸光度A2；对照组：与样品组基本一致，其中的样品换用100 μL蒸馏水即可，用酶标仪检测吸光度A0。每个样品进行三次平行试验，将所得的三组数据求平均值用于结果计算：

式中：

A1——样品组的吸光度值；

A2——空白组的吸光度值；

A0——对照组的吸光度值。

样品浓度设置为0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/mL，得出结果后，根据结果显示的回归方程进行EC50值的计算。

1.2.8.3 螯合金属能力

实验以Jin等[16]的实验作为基础，并进行一定程度的变动：用超纯水配制浓度为2 mmol/L的硫酸亚铁和30%的乙酸钠，用冰乙酸调至乙酸钠pH为5.0后作为溶剂配制5 mmol/L的菲咯嗪溶液；在1 mL最终浓度为1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、20.0 mg/mL的样品中，分别添加0.05 mL浓度为2 mmol/L的硫酸亚铁溶液以及1.85 mL超纯水并充分混匀，静置3 min。然后在处理好的样液中添加0.1 mL浓度为5 mmol/L的菲啰嗪溶液，混匀，室温下静置10 min；每个浓度的样品溶液中各取出0.25 mL加入到96孔板中，在562 nm处测吸光值A1。空白组A0：用1mL超纯水代替样品，其他条件相同；每个样品进行三次平行试验，将所得的三组数据求平均值用于结果计算：

式中：

A1——加入样品的吸光度；

A0——空白组的吸光度。

样品浓度设置为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL，得出结果后，根据结果显示的回归方程进行EC50值（螯合50% Fe2+时的样品浓度）的计算。分别测试浓度样品的Fe2+螯合能力，采用非线性回归计算其EC50值。

1.3 数据处理

每个试验重复进行3次，结果取平均值。采用Microsoft Excel 2016对数据进行整理，并进行拟合和作图分析，使用Design-Expert V.8.0.6进行响应面优化设计。

2 结果与分析

2.1 最优发酵菌种的确定

由图2a可以看出，米曲霉、黑曲霉在发酵过程中，酶活力逐渐升高，在发酵96 h时达到最大值，之后逐渐下降，且米曲霉的酶活力明显高于黑曲霉。发酵初始阶段，菌体不断增殖，产酶能力也不断增强，酶活力随之升高，当发酵至96 h左右时，酶活力达到最高水平，后期因菌体生长进入衰老期，其产酶能力减弱，菌体酶活力也就随之下降[17]。米曲霉的主要产物是中性蛋白酶和碱性蛋白酶，而黑曲霉的主要产物是酸性蛋白酶，中性蛋白酶酶活处于较低水平[17]，故而，米曲霉的酶活力（本实验所测为中性蛋白酶）高于黑曲霉。由图2b可以看出，在中性蛋白酶酶活力实验的基础上，发酵96 h测定OD540nm，结果显示，米曲霉发酵培养基中的活性肽含量高于黑曲霉。相对黑曲霉，米曲霉产中性蛋白酶能力较强，酶活力较高，因而选用米曲霉作为实验的发酵菌种。

2.2 单因素实验

以OD540nm为指标，米曲霉为发酵菌种，研究不同因素（发酵时间、含水量、起始pH、接种量）对于辣木叶活性肽含量的影响。

2.2.1 发酵时间

由图3可知，随着发酵的进行，OD540nm在96 h达到最高值，之后又呈现下降趋势，这一结果与发酵菌种筛选过程中的结果相符。因此，确定96 h为最优发酵时间。

2.2.2 含水量

从图4可以看出，当含水量为50%时，OD540nm最高。含水量低于或高于50%时，OD540nm呈现下降趋势。米曲霉是好氧微生物，在微生物生长发育、繁殖产酶时期均需要一定的水分参加生理反应，同时含水量还会影响培养基中各物质的溶解及酶解反应。当含水量较低时，可溶性营养物质的溶解不充分，不利于微生物生长、酶生产及酶水解过程；含水量过高时，会使固体培养基变为糊状，透气性差，不利于微生物的繁殖，甚至导致微生物的死亡，因此，最适发酵含水量应为50%。

2.2.3 起始pH

由图5所示，pH为5时，OD540nm最高，当pH超过5后，OD540nm降低。每种菌都有其最适pH和耐受pH范围，pH的变化可以影响细胞膜上的电荷，从而影响米曲霉对营养物质的吸收，进而影响米曲霉的新陈代谢，最终引起蛋白酶酶活力的改变。结果显示，pH为5时，米曲霉生长旺盛，利于发酵，故而OD540nm最高，即含量最高。

2.2.4 接种量

由图6可知，在发酵过程中，OD540nm随接种量的增加呈现先增加后减少的趋势。接种量在较低水平时，随着接种量的增加，米曲霉在发酵过程中的生长繁殖速度加快，产酶量增加，但接种量过大，一定时期内菌种繁殖量过大导致氧气、营养等不足，反倒对酶的活性产生抑制作用，导致OD540nm呈现下降的趋势[18,19]。因此，选择14%作为最优接种量。

2.3 响应面优化

2.3.1 响应面因素水平设计与结果

在单因素实验的基础上，根据Design-Expert. V.8.0.6软件中Box-Behnken中心组合试验设计原理，选取培养基含水量（A）、米曲霉接种量（B）和发酵时间（C）作为变量，以OD540nm（Y）作为响应值进行因素水平设计，具体响应面试验因素水平设置见表1，各组试验设计结果见表2。

表1 响应面试验因素水平表 Table 1 Response surface test factor level table

表2 响应面设计方案及结果 Table 2 Response surface design scheme and results

2.3.2 响应面设计回归模型的建立及方差、可信度分析

利用Design-Expert 8.0.6对表2中的实验数据进行二次多元回归拟合，得到二次多项回归方程：Y=4.75 ×10-3A+8×10-3B-3.5×10-3C+7.5×10-4AB-2.5×10-4AC+ 1.25×10-3BC-0.013A2-0.022B2+1.25×10-4C2+0.13

进一步对拟合出的回归方程进行方差分析，结果见表3。此回归模型达到显著水平（p＜0.05），失拟项不显著（p>0.05），建立的二次模型稳定[19]，可用于推测相关发酵条件下的辣木叶活性肽含量。一次项B（p＜0.05）、二次项A2（p＜0.05）和B2（p＜0.01）均达到显著水平。根据各影响因素的F值大小可知，3个因素各因素影响OD540nm的主次顺序为：B（米曲霉接种量）＞A（培养基含水量）＞C（发酵时间）。

2.3.3 响应曲面图分析

培养基含水量、米曲霉接种量、发酵时间三个因素间两两交互作用对OD540nm的影响见图7。交互作用的强弱可由三维立体图平缓程度来反映，响应面坡度越陡，表明条件改变对响应值的影响越大[20]。

由图7可以看到，所有响应曲面图均呈向上突起状，BC和AB交互作用的响应曲面图较AC更陡，倾斜度更高，因此米曲霉接种量（B）和发酵时间（C）、培养基含水量（A）和米曲霉接种量（B）的交互作用明显，与表3回归模型方差分析结果一致。

2.3.4 最佳发酵工艺条件的验证试验

通过响应面实验模型预测，培养基含水量52.39%、米曲霉接种量14.71%、发酵时间72 h时，OD540nm达到极值点，此时的OD540nm为0.132。为验证响应面实验所建立模型的可行性，在此工艺参数下进行3次固态发酵实验，测得平均OD540nm为0.130，与预测值0.132相对误差1.5%，模型拟合度良好。

因此，米曲霉固态发酵制备辣木叶活性肽的优化工艺条件为：培养基起始pH为5、含水量52.39%、米曲霉接种量14.71%、发酵时间72 h、发酵温度30 ℃。

2.4 辣木叶活性肽抗氧化活性分析

2.4.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一种含有奇数个电子的稳定自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在517 nm下有最大吸收值。当体系有抗氧化试剂存在时，两分子的DPPH自由基可与抗氧化物质结合，形成一分子DPPH抗氧化物质复合物和一分子DPPH还原态分子，此时在517 nm下的吸收值降低，因此，可用来评价物质的抗氧化活性[21]。

不同浓度的辣木叶活性肽对DPPH自由基清除能力见图8，结果显示，活性肽质量浓度在0.1～1 mg/mL时，DPPH自由基清除率随着浓度增大而显著增大，浓度为1 mg/mL时清除率可达到91.45%。继续增加活性肽浓度，自由基清除率增长趋于平稳。辣木叶活性肽对清除DPPH自由基的EC50为0.42 mg/mL。李露等[22]用碱性蛋白酶水解牦牛皮蛋白制备的抗氧化肽清除DPPH自由基的EC50为2.884 mg/mL。Liang等[23]使用不同酶对辣木籽进行酶解并对得到的活性肽进行超滤，得到抗氧化能力最强的活性肽DPPH自由基清除率的EC50为4.0 mg/mL。与本实验相比，发现采用米曲霉进行固态发酵得到的辣木叶活性肽对DPPH自由基的清除能力更强，具有更高的抗氧化活性。

2.4.2 ABTS自由基清除能力

ABTS能与活性氧反应生成蓝绿色的ABTS自由基，在734 nm有最大吸收峰。当体系中存在抗氧化物质时，抗氧化物质能够与该呈色离子发生反应而使呈色离子的颜色变浅[24]，734 nm的吸收值相应减小，因此，可用于评价抗氧化反应的程度。

图9显示，在质量浓度为0.025～0.2 mg/mL范围内，ABTS自由基清除率大小与辣木叶活性肽质量浓度呈现量效关系，浓度上升至0.2 mg/mL时，清除率高达97.25%。继续增加辣木叶活性肽浓度，对自由基清除率的影响很小，ABTS自由基清除率的EC50为0.059 mg/mL。贾蕾等[25]采用酶解法制备碎米荠硒肽并测定其抗氧化能力，结果显示其ABTS自由基清除率的EC50为0.399 mg/mL。Wang等[26]发现最优酶解条件下酶解得到的棉籽肽的ABTS自由基清除率的EC50为2.05±0.02 mg/mL。由此可见，辣木叶活性肽在低浓度下对ABTS自由基有较强的清除效果。

2.4.3 螯合金属能力

以Fe2+为代表的变价金属离子能加速氧自由基的产生，从而加速食品中蛋白质、脂质的氧化。抗氧化剂清除氧自由基的能力有限，若能同时通过螯合金属离子来减少氧自由基产生，则能达到更佳的抗氧化效果[27,28]。因此对辣木叶活性肽螯合Fe2+的能力进行评估，也能反映其抗氧化活性。菲啰嗪作为一种发色螯合剂，可强烈螯合Fe2+形成一种稳定的红色配合物，在562 nm处有较强的吸收能力。当可以与Fe2+进行螯合的试剂与菲啰嗪同时存在时，该试剂与菲啰嗪争夺Fe2+使菲啰嗪与Fe2+形成的螯合物减少，造成配合物红色变浅，因此可以通过测定在该波长处颜色减退来评估试剂与Fe2+的螯合能力[29]。

图10显示，在质量浓度为1～20 mg/mL时，样品浓度的大小与Fe2+螯合率呈正相关关系，当质量浓度达到10 mg/mL时，螯合率达到50.83%，继续增加辣木叶活性肽的浓度，螯合率趋于平稳，其EC50=9.76 mg/mL。随着肽浓度的增加，对Fe2+的螯合能力增强，这可能是因为活性肽浓度的增加使得肽与Fe2+间相互接触的几率更大所致。明强强等[30]使用黑曲霉固态发酵制备的花生活性肽分子量大于10 ku时Fe2+螯合率的EC50=15.96 mg/mL，毛晶等[31]对松仁谷活性肽进行分离纯化与测序合成后，得到的抗氧化肽在1000 μmol/mL时Fe2+螯合率为48.66%。与本实验对比发现，辣木叶活性肽有较强的金属螯合能力。

2.5 氨基酸组成分析

在最优发酵条件下制备的辣木叶活性肽的氨基酸组成及含量如表4所示。

表4显示，辣木叶活性肽共检出17种氨基酸，与抗氧化活性相关的肽段氨基酸包括Asp、Phe、Tyr、Glu、Lys、His、Pro、Cys等[7]，其中含量最高的氨基酸为Glu（19.10%），其次为Asp（11.21%），符合植物蛋白的组成[32]。Kim等[33]对辣木叶干粉的氨基酸组成进行了检测，与我们发酵制备的辣木叶活性肽的氨基酸组成对比分析发现，二者氨基酸组成相同，但不同氨基酸占总氨基酸的含量略有变化。发酵制备得到的辣木叶活性肽中，Glu含量提高了2.91%，His含量提高了3.85%；Asp、Tyr的含量与发酵前相比略有减少，但总体变化不大。发酵前后氨基酸含量发生变化的原因可能是由于发酵过程并未将辣木叶蛋白完全转化为活性肽而导致氨基酸含量降低，也可能由于米曲霉自身产生了代谢物而导致部分氨基酸升高。辣木叶活性肽的抗氧化活性与氨基酸的组成有密切关系。酸性氨基酸（如Glu和Asp）带负电，能和金属离子相互作用（如螯合作用），减少超氧阴离子及羟基自由基的产生，从而抑制氧化链式反应[7]。王颖颖等[34]在使用不同蛋白酶对牡丹籽蛋白进行酶解后发现，酸性氨基酸含量高的水解产物，其抗氧化能力也更强。Yu等[35]分别合成了含有和缺失Glu-Asp序列的多肽并对比其抗氧化活性，确定了Glu-Asp的联合作用能提高多肽的抗氧化能力。本试验中，辣木叶活性肽中的Asp和Glu含量较高，起到了一定的抗氧化作用。芳香族氨基酸有质子供体的作用，能与自由基结合形成中间体，并通过中间体之间的共振维持稳定[36]，从而阻断或减慢自由基链式反应。曾剑华等[32]研究也发现，Tyr对ABTS阳离子自由基有较强的清除效果，抗氧化能力达到186.29 mmol/kg。因此，辣木叶活性肽中的Tyr（含量3.38%）对抗氧化性也起到了正向作用。碱性氨基酸中的His由于咪唑基的降解而使其具有自由基清除能力[37]，表明本试验中的His（含量6.23%）也是辣木叶活性肽的抗氧化能力来源之一。另有研究证实，肽段中特定的氨基酸序列具有强抗氧化性。Asp、Glu中的-COOH是吸电子基团，与Tyr相邻时能使Tyr酚羟基上的氧电子云密度降低，促使质子释放，提高Tyr的供氢能力，从而增强肽段的自由基清除能力[38]；肽段的N端为疏水性氨基酸时，脂肪族烃侧链更利于抗氧化肽与活性氧结合[39]，增强其抗氧化活性，Chen等[40]、杨保军等[41]也发现，大部分抗氧化肽在N端包含疏水性氨基酸（如Val、Leu）。综合分析，辣木叶活性肽中的氨基酸组成及特征氨基酸序列结构是使得辣木叶具有强抗氧化活性的原因，后续研究将进一步对辣木叶活性肽的肽段组成和氨基酸序列进行深入分析。

3 结论

本实验利用米曲霉固态发酵法制备辣木叶活性肽，确定最佳发酵工艺为米曲霉作为最优菌种，发酵温度30 ℃，发酵时间72 h，培养基含水量52.39%，接种量14.71%，pH为5。在最优工艺条件下得到的辣木叶活性肽具有较好的抗氧化活性，且富含17种氨基酸，其中酸性氨基酸和疏水性氨基酸含量较高。本研究为辣木叶活性肽功能性产品的研发提供了一定的参考，有一定的理论指导意义。