凉果中优势腐败霉菌的分离鉴定

倪泽平，孙尧华，宋贤良,2*

（1.华南农业大学食品学院，广东广州 510642）（2.广东省食品质量安全重点实验室，广东广州 510642)

凉果也称为蜜饯，是我国传统特色的休闲食品，其口感清爽、风味独特、保质期长，广受消费者欢迎。凉果的传统加工方法是以青梅、杏、佛手等原料经盐 腌或糖渍、干燥、调味等工艺制成的干型和半干型制品，制作工艺对生产设备要求较低，多以传统手工方式为主[1]，整个生产过程中卫生管理不严格或未设有微生物监测程序，加之长时间渗糖易导致糖液发酵，微生物超标。其次，凉果浸糖不足，含水量较高或后期贮藏温度高、潮湿、通风不良等也会导致细菌与霉菌超标[2]。余元善等[3]对广式凉果成品进行微生物种群调查，发现32株芽孢杆菌属，5株霉菌，包括曲霉属、毛霉属、青霉属。微生物及次级代谢产物污染不仅给凉果生产加工企业和消费者带来巨大的经济损失，也会危害人体健康[4]。因此防止凉果在生产、贮藏期间微生物污染是急需解决的问题。

目前有关凉果微生物污染分析及控制的研究已经开展。陈荷凤等[5]调查了果脯蜜饯的细菌污染情况，结果发现芽孢杆菌污染占总污染菌的92%。国家食品药品监督管理局抽检，检出奶油葡萄干的霉菌数超过国家标准的239倍[6]。高慧等[7]认为蜜饯生产贮藏中常见的腐败菌为灰葡萄孢菌和扩展青梅。刘小翠等[8]对市售杏脯进行微生物指标测定，结果显示放线菌、酵母菌为主要超标菌。J.VARGA等[9]研究来源不同国家的葡萄干表面的霉菌污染情况，数据表明，葡萄干表面的黑曲霉和盛泡曲霉是其主要污染源，且污染量对食品安全造成了威胁。Martorell等[10]发现高糖食品中，最主要分离出的是接合酵母菌，此菌属耐受防腐剂、SO2等，是造成蜜饯霉变的主要菌属。由于凉果的含糖量在60%～70%，具有较高渗透压，且水分活度较低，所以一般的细菌不易存活，但部分芽孢杆菌与霉菌抵抗力强，耐渗透压，在凉果生产加工及贮藏过程中极易存在[11]。当前对凉果成品中的腐败霉菌鉴定研究较少，且未对凉果在常温贮藏条件下的优势腐败霉菌进行深入探究。对凉果贮藏中存在优势腐败霉菌进行分离鉴定，是为实现凉果杀菌与安全贮藏的关键步骤。

因此本文以葡萄干、话梅、杏脯为实验对象，对其在常温贮藏四个月后滋生的腐败霉菌进行分离与纯化，通过回接侵染实验筛选出优势腐败霉菌，采用传统的形态学观察初步鉴定霉菌种类结合简单、高效的分子生物学方法18S rDNA和内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）序列分析技术，对优势霉菌的核糖体基因ITS区进行特异性PCR扩增，鉴定出优势霉菌，以期为凉果霉菌的分离纯化鉴定提供可靠的方法，也为选择后续杀菌方法、优化贮藏条件提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

葡萄干、话梅、杏脯均由广东康辉集团提供；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato Dextrose，PDA）、孟加拉红培养基（Rose Bengal Medium，RBM）均购于广东环凯微生物科技有限公司；聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）引物由广州微生物研究所合成；真菌基因组DNA抽提试剂盒购于深圳子科生物科技公司；其余试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

G/36DWS高压灭菌锅，致微仪器有限公司；LRH-250生化培养箱，上海一恒科技仪器有限公司；MW-GZT-SZS2000C101超净工作台，东莞市美维净化设备有限公司；SHA-BA水浴恒温振荡器，常州澳华仪器有限公司；EM ACE600真空镀膜仪，德国徕卡仪器有限公司；S1000-96型梯度PCR仪，美国伯乐有限公司；Gel DOC XR+凝胶成像系统；DYY-8C电泳仪，北京六一仪器厂；ST16R台式冷冻离心机，美国赛默飞世尔科技公司；Axio Observer A1倒置荧光显微镜，卡尔蔡司公司。

1.2 方法

1.2.1 葡萄干、话梅、杏脯贮藏期霉菌的分离纯化

常温储藏4个月的葡萄干、话梅、杏脯各25 g，放入盛有225 mL生理盐水中，180 r/min振荡30 min，制成10倍系列稀释样品菌液。取1 mL稀释液于90 mm无菌培养皿，及时倒入冷却至47 ℃的PDA、RBM 15～20 mL并与样品混合均匀，培养基凝固后，将平板翻转，置于28 ℃恒温生化培养箱中培养5～7 d，霉菌分离纯化实验平行重复三次。待菌落长出后，观察菌株形态，并用接种环挑取典型的霉菌接种到PDA中做有规则的划线，经过多次划线得到纯种单菌株。将纯种菌株接种于PDA斜面培养基上培养至长满斜面，4 ℃保存备用。

1.2.2 优势腐败霉菌的筛选

将分离出的菌株分别接种至PDA固体培养基中，28 ℃培养7 d，用适量无菌水将孢子洗脱到装有玻璃珠的250 mL无菌锥形瓶中，震荡摇匀，调节孢子浓度为106～107CFU/mL。采用10% NaClO对葡萄干、话梅、杏脯消毒杀菌，晾干后备用[12]。将无菌的葡萄干、话梅、杏脯分别浸泡不同的孢子悬浮液中1 min，作为处理组，将喷洒无菌水的葡萄干、话梅、杏脯作为对照组。回接霉菌后的葡萄干、话梅、杏脯分别置于无菌密封袋中，室温保藏，观察表面发霉情况，将导致凉果腐败发霉速度最快的菌株确定为优势菌。

1.2.3 优势腐败霉菌的形态特征观察

将分离的纯种菌株，用无菌接种环挑取单个孢子或菌落，点植培养于PDA培养基，方式为点植于等边三角形三个顶点，倒置于28 ℃恒温生化培养箱中培养7 d，观察其形态，包括菌落大小、颜色、气味、边缘特征、菌丝生长状况等。

1.2.4 优势腐败霉菌的显微结构观察

5)综合而言，斜放四角锥受力更为合理，刚度较大，并且焊接球节点数量较少，因此本工程阀厅屋盖采用斜放四角锥三层网架。

采用载玻片观察法，在载玻片中央滴加一滴乳酸苯酚溶液，用接种环挑取菌落边缘的菌丝，平铺于载玻片中，盖上盖玻片，避免气泡产生。先用低倍镜找到菌落位置，在换成高倍镜观察霉菌分生孢子、分生孢子梗形态、横膈膜数量等。对照真菌鉴定手册[13]、中国真菌志[14]、GB 4789.16常见产毒霉菌的形态学鉴定等资料，对优势腐败霉菌进行初步鉴定。

1.2.5 rDNA-ITS序列分析

1.2.5.1 DNA提取

将所得优势腐败霉菌在PDA培养基培养7 d后，按照真菌基因组DNA提取试剂盒说明书指导提取菌株

DNA。

1.2.5.2 PCR扩增[15]

PCR产物用1%琼脂糖凝胶在90 V条件下电泳1 h，电泳缓冲液为1×TAE，用溴化已锭（Ethidium Bromide，EB）染色，用UV凝胶成像仪观察。用凝胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，送至广州微生物研究所测序。

测序结果在NCBI中GenBank数据库（http://www. ncbi.nlm.nih.gov）中进行 BLAST（Basic Local Alignment）序列相似性对比，基于ITS序列邻接法（Neighbor-joining），选取同源性较高菌株的ITS序列，用MEGA 6.06（Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version）软件构建发育树，确定菌株的种属类别。

2 结果与讨论

2.1 葡萄干、话梅、杏脯储藏中腐败霉菌的分离

葡萄干、话梅、杏脯常温储藏4个月后，对其腐败霉菌进行2～3次分离纯化，共分离出17株菌株。从葡萄干中分离出5种霉菌14株，分别命名为S1～S5，其中S1分离出7株，S2分离出3株，S3分离出1株，S4分离出1株，S5分离出1株；从话梅中分离出1种霉菌2株，命名H1；从杏脯中分离出1株霉菌，命名为X1。由图1可知，霉菌S1在PDA中呈灰绿色，蔓延式生长，菌丝绒毛状，凸起，有白色菌丝外圈，无渗透液，反面接近黑色；霉菌S2菌落中心为青色，粉末状，外围为灰色菌丝，质地紧密，有霉味，菌落中心反面为白色，外围呈黄色。霉菌S3菌落呈乳白色，绒毛状，蔓延式生长，整体平坦，菌落反面呈淡黄色。霉菌S4菌落中心有致密的绒毛状菌丝，毡状或绒毛状，凸起，外围为黑色菌丝且较为粗糙，生长迅速，菌落反面呈黑色。霉菌S5菌落中心呈白色，绒状，整体较为平坦，反面颜色不变，生长较为缓慢。霉菌H1在PDA中菌落中心呈灰褐色，外围为灰色菌丝，致密的绒状，凸起，生长迅速，菌落背面的颜色加深，霉菌X1菌落呈柠檬黄色，蔓延式生长，绒毛状或絮状，整体向上凸起，外围为白色菌丝圈，菌落背面颜色不变。

2.2 优势腐败霉菌的筛选

从已经发生霉变的凉果中分离出的7种菌，制成106～107CFU/mL孢子悬浮液，分别回接至无菌的葡萄干、话梅、杏脯中。回接S3、S4、S5的凉果虽然有异味，但表面无明显霉变现象。而霉菌S1、S2、X1、H1在回接18～20 d内，便导致凉果霉变：葡萄干与对照组相比表面出现了黄色霉斑，并伴随一股酸臭味；话梅表面颜色加深，局部返砂，出现深褐色霉斑，霉斑附近有白色菌丝，与常温贮藏4个月的话梅霉变现象相同；杏脯发生了明显褐变，并有亮黄色的霉斑。由于比凉果常温贮藏4个月和回接霉菌S3、S4、S5发生变质的时间大大缩短了，因此把导致凉果腐败发霉速度最快的霉菌S1、S2、X1、H1确定为优势菌。

2.3 优势腐败霉菌的显微结构

霉菌S1、S2、H1、X1的显微镜下的形态如图3。S1的分生孢子呈圆形或椭圆，分生孢子梗直立单生或簇生，少有分支，无分隔。S2分生孢子呈球形壁光滑，分生孢子梗顶端帚状，有一串孢子。H1菌丝多有分隔，分生孢子呈椭圆或卵形，具有明显的喙或尖端有明显的凸起，孢子有横、纵或斜的真隔膜，表面光滑，分生孢子梗短粗，多分生或簇生。X1的分生孢子梗有指状分支，似帚状，有隔膜，小梗顶部的分生孢子头呈椭圆或圆状。

2.4 优势腐败霉菌的rDNA-ITS序列分析

选择真菌通用引物ITS/ITS4对4株优势霉菌的rDNA-ITS进行特异性扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4，其中泳道M：DNA标准分子量为DL1000，霉菌S1、S2、H1、X1的ITS序列分别为462、439、478、492 bp。将优势霉菌的PCR扩增序列在NCBI中Genbank中已知的菌株进行相似性对比，选取同源性较高的菌株，将其ITS全序列用MEGA 6.06软件构建系统发育树。

图5表明霉菌S1与芽枝状枝孢霉（Cladosporium velox）ITS序列在同一分支，表明他们的亲缘关系相近，同源性为100%，结合对霉菌S1的形态特征观察、ITS序列的相似性及系统发育树结果，鉴定霉菌S1为芽枝状枝孢霉。霉菌S2与柠檬黄青霉（Penicillium citreosulfuratum）、暗黄青霉（Penicillium citreonigrum）、毒青霉（Penicillium toxicarium）等亲缘关系相近，同源性均达99.77%，结合对霉菌S2的形态特征观察、ITS序列的相似性及系统发育树结果，鉴定霉菌S2为暗黄青霉。霉菌H1与六出花链格孢（Alternaria alstroemeriae）、巴恩斯链格孢（Alternaria burnsii）、细极链格孢（Alternaria tenuissima）等亲缘关系相近，同源性均达100%，结合对霉菌H1的形态特征观察、ITS序列的相似性及系统发育树结果，鉴定霉菌H1为细极链格孢。霉菌X1与菌核青霉（Penicillium sclerotiorum）亲缘关系相近，同源性均达100%，结合对霉菌X1的形态特征观察、ITS序列的相似性及系统发育树结果，鉴定霉菌X1为菌核青霉。

凉果在贮藏与销售过程中，因操作不规范、卫生状况不达标等原因，极易导致凉果霉变。霉菌污染不仅降低产品品质，而且产生的毒素及次级代谢物还会危害人体健康。对凉果常温贮藏中的优势霉菌进行分离鉴定，是针对性选择后续杀菌保鲜工艺及参数的重要基础。目前优势霉菌的筛选方法不统一。李维蛟等[16]从三七中药材分离出的霉菌数量占优势的菌株视为优势菌。郑云华[17]将在整个茶渥堆发酵过程中一直存在的青霉与曲霉作为优势菌。岳晓禹等[18]以肉眼可见占生长优势的霉菌作为玉米贮藏过程中优势霉菌。牛佳佳等[19]将分离纯化后的霉菌回接，验证霉菌致腐能力，以确定腐败霉菌。本实验也采用回接浸染试验，将分离纯化后的5株霉菌回接葡萄干表面、1株霉菌回接话梅表面、1株霉菌回接杏脯表面，通过凉果霉变时间长短来分别确定葡萄干、话梅、杏脯中的优势腐败霉菌，极大提高实验结果的可靠性。传统的霉菌鉴定主要依据霉菌在培养基的形态、显微镜下的结构与生理生化指标鉴别。生理生化不仅操作繁琐，而且不能对霉菌进行精准的鉴定[20,21]。本实验在传统的形态观察和显微结构的基础上，结合简单高效的rDNA-ITS序列分析法，提高霉菌鉴定的可靠性[22,23]。

青霉属、曲霉属、链格孢属均属于常见的食品腐败霉菌。Gündüz等[24]、Cetinkaya等[25]经研究发现葡萄干表面优势霉菌主要为曲霉属、贝氏菌属、散囊菌属和青霉属，杏脯的霉菌主要为曲霉、链格孢、青霉。刘彬[26]、陈存坤等[27]、吴思雅等[28]、袁乙平[29]从葡萄干中主要分离出了曲霉及其赭曲霉毒素，从杏脯、话梅的原料即采后的杏和青梅中发现，青霉属和链格孢属同样是优势腐败霉菌。本实验从葡萄干、话梅、杏脯致腐霉菌中分离出了枝孢属霉菌、链格孢霉菌、青霉菌，研究结果与其他研究者的结论存在差异，推测可能是地域、加工条件等影响。

3 结论

对葡萄干、话梅、杏脯在常温贮藏过程中生长的霉菌进行分离纯化，通过传统的培养基中真菌形态特征、显微镜观察结合PCR扩增测序分子生物学法对引起葡萄干、话梅、杏脯腐败变质的优势霉菌鉴定，确定葡萄干的优势霉菌为芽枝状枝孢霉和暗黄青霉，话梅的优势腐败菌为细极链格孢，杏脯的优势腐败霉菌为菌核青霉，为今后防止凉果在生产加工及销售贮藏中腐败变质，选择适宜的杀菌保鲜方式提供了参考依据。