藏羊源纤维素降解菌-沙福芽孢杆菌的分离鉴定 及其生物学特性

徐淑琴，马祥兆，陈晓慧，贺曦，贺晓龙，冶贵生*

（1.青海大学农牧学院动物医学系，青海西宁 810016）

（2.青海省动物疾病病原诊断与绿色防控技术研究重点实验室，青海西宁 810016）

纤维素作为光合作用的主要产物，是地球上含量最丰富、分布最广泛、永不枯竭的可再生资源[1]。纤维素因分子结构特殊，通常的酶分子和化学试剂难以与纤维素表面致密结构结合，对其进行破坏分解[2]，这造成了纤维素利用率低下。纤维素的开发与利用几乎都是通过生物降解法完成的[3]，该方式具有环保、高效、经济等特点[4]。真菌、细菌和放线菌是主要产生纤维素酶的微生物[5]。纤维素降解菌具有培养简单、发酵周期短、生长速度快、耐高温等优点，目前已被广泛应用于多个领域，如微生态添加剂、秸秆还田和重金属污染修复等[6,7]。

纤维素降解菌类中的芽孢杆菌产酶丰富，酶活性相对其他菌株较高，能产生大量的纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶等，提高原料的利用率[8]。芽孢杆菌可形成休眠芽孢，具有抗逆能力强、抑菌谱广、代谢产物丰厚、培养周期短等特点，目前对该菌属报道较多的有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌。芽孢杆菌在发酵、生防、微生态制剂等方面有重大的研究意义和应用前景[9]。徐同伟等[10]从烟草病株根际土壤中筛选出的沙福芽孢杆菌可有效控制烟草黑胫病危害和提高烟草产量；Rong等[11]从桂花中分离出沙福芽孢杆菌具有抗真菌活性，是一种防治稻瘟病的生物农药；李庆荣等[12]从蚕沙中分离出沙福芽孢杆菌有溶磷解钾作用可改良土壤，提高土壤肥力；da Fonseca等[13]从石油中分离出负责降解芳香族化合物和石油芳烃馏分的沙福芽孢杆菌。沙福芽孢杆菌已在农业、生物防治、石油化工等方面被深入研究并得到了广泛应用。

藏羊生活在海拔高、低温、低氧的青藏高原，对严酷的自然环境有较强的适应能力和耐粗饲料的特点，使得藏羊消化道微生物具有较高的生物学研究价值[14]。本实验从青海健康藏羊瘤胃液中分离、筛选出纤维素降解菌，利用形态学观察、生理生化特性和16S rDNA分子鉴定等方法鉴定分离菌株的种类及系统分类地位，并对分离菌株的生长特性、抑菌能力和药物敏感性等生物学特性进行研究，以期为纤维素酶制剂的开发和藏羊可持续发展提供潜在候选菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品及菌株

藏羊瘤胃液采集于青海省海北藏族自治州某养殖场。大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌分离菌株，均由青海大学农牧学院青藏高原动物疾病研究室保存。

1.1.2 试剂

纤维素刚果红培养基、细菌生化鉴定管、MH琼脂（MHA）、胰蛋白胨大豆肉汤，均购于青岛海博生物技术有限公司；药敏纸片购于杭州微生物试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

T100™ ThermalCycler PCR仪，美国BIO-RAD公司；LRH生化培养箱，上海一恒科技有限公司；AC2-4S1生物安全柜，新加坡艺思高科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 纤维素降解菌的分离筛选及形态学观察

用胰蛋白胨大豆肉汤对采集的瘤胃液进行增菌培养。蘸取增菌液划线于纤维素刚果红培养基，37 ℃恒温培养48 h。挑选粉红色单菌落分离纯化后观察菌落生长情况，并用革兰氏染色法制片观察菌体形态结构[15]。

1.3.2 分离菌株的生理生化鉴定

选取革兰氏阳性、有芽孢的杆状菌株进行生理生化鉴定，具体方法参照《伯杰氏细菌系统鉴定手册》（中文第8版）[16]，挑取纯化后的单个菌落接种于生化鉴定管，在37 ℃培养24 h后观察结果。

1.3.3 分离菌株的16S rDNA鉴定

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌株基因组，用细菌的通用引物对分离株进行16S rDNA[17]片段扩增。扩增产物经1%琼脂糖凝胶检测后进行测序。将得到的测序序列提交至NCBI中进行Blast比对，选取相关近缘菌株序列用MEGA 7.0软件中的邻接（neighbor-joining，NJ）法聚类构建系统发育树[18]。

1.3.4 生长曲线的测定

将分离菌株菌液浓度调整为0.5个麦士比浊度，接种LB液体培养基，180 r/min 37 ℃恒温培养26 h，每2 h测定其在600 nm处吸光度值[19]，记录数据并绘制生长曲线。

1.3.5 抑菌实验

将致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及产气荚膜梭菌（1×108CFU/mL）涂布于营养琼脂上，放置四联式牛津杯，将培养的分离菌株菌液接入牛津杯中，培养皿4 ℃下放置12 h后，37 ℃恒温培养12 h，测量抑菌圈直径[20]。

1.3.6 药物敏感性试验

采用纸片扩散法（Kirby-Bauer法）[21]检测分离菌株对30种抗生素的敏感程度，将分离菌株菌液浓度调整为0.5个麦士比浊，涂布于MH平板表面，将药敏片贴于平板表面，37 ℃恒温箱中培养18 h～24 h，记录抑菌圈的直径。依据国家临床实验室标准委员会（National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）的标准进行判定结果。

1.3.7 数据处理

实验结果采用Excel整理试验数据并处理绘图。

2 结果与讨论

2.1 纤维素降解菌的分离筛选及形态学观察结果

纤维素刚果红培养基筛选结果如图1a，分离菌株的菌落呈圆形、表面光滑、边缘整齐，培养初期为粉红色小菌落，后期中间乳白略带粉色边缘有透明圈。在光学显微镜下观察到菌体为单个直杆状、两端钝圆、有芽孢，革兰氏染色结果如图1b，分离菌株呈阳性，将其命名为BS1-ql。研究表明食草反刍动物消化道内共生的细菌、真菌等微生物能够分泌纤维素酶，可帮助分解纤维素为动物提供能量[22]。本研究以纤维素为单一碳源的刚果红培养基筛选纤维素降解菌，通过观察长出菌落颜色及形态特点判定该菌株是否能降解纤维素，操作简单便捷，结果可靠高效。但难以判断产酶水平的高低，需要通过酶活测定法精确测定菌株产酶水平的高低[23]。

2.1.1 分离菌株的生理生化鉴定

生理生化试验结果表明，分离菌株BS1-ql能够利用甘露醇、水杨苷、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖作为单一碳源，不能利用西蒙氏枸橼酸盐和丙酸盐，且不能还原硝酸盐；过氧化氢酶和氧化酶检测呈阳性（表1）；生长pH值在5.7，能耐受7% NaCl环境，不能水解淀粉。生理生化结果符合芽孢杆菌的特征，且通过对菌株形态特征的观察，并对照《伯杰细菌鉴定手册》，初步将菌株BS1-ql鉴定为芽孢杆菌属。

表1 生理生化鉴定试验结果 Table 1 Biochemical identification results

2.1.2 分子鉴定结果

PCR扩增结果如图2显示，分离菌株所在泳道出现长度在1400 bp左右的目的条带，测序序列显示其长度为1422 bp，同源比对结果表明分离菌株与参考芽孢杆菌菌株同源性均在87%以上、与沙福芽孢杆菌同源性高达100%且处于进化树同一分支上，如图3，亲缘关系最近。结合菌株形态特点与生理特征，鉴定分离菌株是沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis）。

传统的细菌鉴定方法操作繁琐、试验周期长且存在主观判断。生理生化鉴定通过测定pH变化和底物利用，可验证细菌间新陈代谢的方式、产物的不同，再利用被称为细菌鉴定“金标准”的16S rDNA基因检测技术就可以实现对微生物快速、微量、精确地鉴定分析[24]。耿晓杰等[25]研究采用16S rDNA基因测序和序列比对分析从青稞小曲中分离到5种芽孢杆菌。Shafi等[26]使用不同的鉴定方法，包括传统的、生物化学的和分子方法精准的鉴定分离出湖水内的16株细菌。本试验与上述研究相同，通过形态学观察、生理生化试验及16S rDNA分子鉴定相结合，短时间内可明确分离菌株为沙福芽孢杆菌。分离筛选的藏羊源沙福芽孢杆菌BS1-ql V-P试验为阴性，与大黑山土壤中[27]分离的沙福芽孢杆菌不同；与中华鳖肠道中[28]分离的2株沙福芽孢杆菌的硝酸盐还原、甲基红、淀粉水解试验结果不一致，可能是由于不同来源或同一来源的菌株之间生化特性会有所差异。

2.2 生长曲线的测定

分离菌株BS1-ql的生长曲线如图4所示，沙福芽孢杆菌生长速度较快，0 h～2 h为迟缓期，2 h后细菌开始快速繁殖进入对数生长期，14 h～18 h菌体量趋于稳定，到18 h～22 h内菌体量又迅速增加，22 h后生长速率逐渐降低进入到平稳期。

2.3 抑菌实验结果

分离菌株BS1-ql对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌分离株的抑菌圈直径分别为8.96、10.34、13.74、14.90 nm，结果表明沙福芽孢杆菌BS1-ql对这4种致病菌有一定抑制能力，对产气荚膜梭菌的抑制能力最强。芽孢杆菌主要通过竞争、拮抗和诱导这三种作用方式对病原菌产生显著的抑制效果[29]。Abdelli等[30]通过研究沙福芽孢杆菌的表面活性物质发现该菌对表皮葡萄球菌等致病菌有抑制能力和抗肿瘤活性。Ngalimat等[31]报道沙福芽孢杆菌对藤黄微球菌有一定的抑制能力。与之相似，本试验分离的沙福芽孢杆菌BS1-ql对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌均有明显的抑制效果，良好的抑菌活性是沙福芽孢杆菌作为候选益生菌株的重要特征。

2.4 药敏试验

药敏试验结果表明（表2），沙福芽孢杆菌分离菌株BS1-ql对绝大多数抗生素表现出敏感，包括青霉素类的青霉素、氨苄西林和羧苄西林等，氨基糖苷类的新霉素、庆大霉素和卡那霉素等，四环素类、大环内酯类和喹诺酮类；对多肽类的多粘菌素B和万古霉素及头孢类的头孢呋辛中度敏感；而对头孢他啶表现出耐药性。与宋梦思等[32]所报道虾肠道中的沙福芽孢杆菌对头孢噻肟、青霉素、杆菌肽、奥格门汀4种抗生素耐药不同，此次试验分离得到的沙福芽孢杆菌BS1-ql仅对头孢他啶表现为耐药；对其它29种常用抗生素皆表现为不同程度的敏感，说明在藏羊养殖过程中使用的抗生素较少，分离菌株可能含有的耐药基因较少，这降低了抗生素抗性基因传播的风险，减少了对环境及人类健康的威胁。

表2 贝莱斯芽孢杆菌分离株对不同药物的敏感性试验结果 Table 2 The susceptibility test results of Bacillus velez isolates to different drugs

3 结论

本试验从青海藏羊瘤胃中分离筛选到了1株能降解纤维素的细菌，菌落呈圆形、表面光滑、边缘整齐，革兰氏染色呈阳性，菌体为单个直杆状、两端钝圆、有芽孢，能够利用甘露醇等，结合16S rDNA基因分子鉴定结果，最终确定其为沙福芽孢杆菌。该藏羊源沙福芽孢杆菌生物学特性良好；生长周期短，培养2 h后进入对数生长期；抑菌能力强，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌的抑菌圈均在8.96 mm以上；对青霉素、头孢氨苄、诺氟沙星等大多数常见抗生素敏感，仅对头孢他啶抗生素耐药。因此具有潜在的益生价值，这能为该菌藏羊源微生态制剂的研发提供重要基础。