非变性I型胶原蛋白对免疫低下大鼠 免疫功能的调节作用

谢金莉，杜丽晶，王超跃，王乐琪，叶春婷*，严诗楷，肖雪，李莎莎

（1.广州创尔生物技术股份有限公司，广东广州 510663）（2.广州中医药大学第二临床医学院，广东广州 510006）（3.上海交通大学药学院，上海 200240）（4.广东药科大学中医药研究院，广东广州 510006）

胶原蛋白是动物体内含量最丰富的蛋白质，约占动物体机体总蛋白含量的30%[1]，它是所有结缔组织（即皮肤、骨骼、韧带、肌腱和软骨）和实质器官的间质组织的细胞外基质的主要蛋白之一，为组织提供机械强度和生理功能[2]。目前，胶原蛋白主要分类有28种，其中I型胶原蛋白在哺乳动物和人体内的含量最高，约占胶原总量的70%[3,4]。非变性I型胶原蛋白（non-denatured type-I collagen，NDC-I）是保留有独特的三螺旋结构的胶原蛋白，由3条肽链组成，每条肽链约含1050个氨基酸残基，其中三螺旋区由(Gly-x-y)n重复序列组成，x常为脯氨酸，y常为羟脯氨酸或羟赖氨酸[5]。NDC-I多采用酸-酶结合法进行提取，来源主要有牛、猪和鱼等[6-8]。不同物种来源的NDC-I三螺旋区的氨基酸序列具有较高的同源性，非螺旋部分有所差异[9,10]。目前，NDC-I多应用于医疗和化妆品领域，具有止血、修复、保湿、促进细胞黏附和增殖等功效[11-13]。

免疫能力低下是一种由于免疫系统遭到攻击和破坏，机体出现的暂时性或永久性免疫功能障碍的状态，极大地危害人类身体健康。因此，通过一些有效的预防或治疗措施，提高机体免疫力，增强机体的免疫功能，是目前相关科研人员和医务工作者面临的重大课题。研究发现，胶原蛋白能够调节机体免疫活性[14,15]、促进伤口愈合[16]、改善关节炎[17]、缓解骨质疏松[18]等。其中NDC-I作为胶原蛋白的重要类型之一，对机体免疫调节具有一定的作用，但是关于NDC-I对机体免疫功能的调控作用缺乏系统研究，且相关报道较少。

环磷酰胺是临床上常用的一种化疗药物，用于抑制肿瘤细胞的生长。但其对正常细胞有一些毒副作用，能通过杀伤免疫细胞从而影响免疫的各个阶段。因此，在免疫毒理学的研究中，环磷酰胺被广泛应用于制备动物免疫抑制模型[19,20]。本实验采用环磷酰胺诱导的免疫低下大鼠模型，通过多个免疫学指标评估NDC-I对大鼠免疫功能的调节作用，探究其增强免疫力的作用。为今后NDC-I的免疫活性研究提供参考，对充分利用胶原蛋白开发相关保健食品或功能性食品具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠36只，体质量180～200 g，由广东省医学实验动物中心提供，实验单位使用许可证编号：SYXK（粤）2017-0125，许可证号：SCXK（粤）2018-0002。实验动物均于SPF级屏障环境动物房饲养，温度：20～25 ℃，湿度：50%～70%。

1.1.2 药品与试剂

脾氨肽口服冻干粉（Spleen Aminopeptide Oral Lyophilized Powder，SA），购于大连百利天华制药有限公司。注射用环磷酰胺，购于Baxter Oncology GmbH。异氟烷，购于瑞沃德生命科技有限公司。生理盐水购于广东科伦药业有限公司。免疫球蛋白A（Immunoglobulin A，IgA）、免疫球蛋白 G（Immunoglobulin G，IgG）、白介素-2（Interleukin-2，IL-2）、白介素-4（Interleukin-4，IL-4）、白介素-10（Interleukin-10，IL-10）、干扰素-γ（Interferon-gamma，IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）和乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）含量测定试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司。NDC-I（平均分子量300 ku，纯度≥90%）从牛筋腱中提取制备，具有完整三股螺旋结构，由广州创尔生物技术股份有限公司提供。

1.1.3 仪器与设备

ZCS电子天平，东莞市怡雪电子有限公司；SC3610型低速离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司；RT-6100型酶标分析仪，美国伯腾仪器有限公司；R620IP型麻醉机，瑞沃德生命科技有限公司；Sysmex XN-1000V[BI]全自动血液分析仪，日本希森美康公司。

1.2 方法

1.2.1 给药方法和免疫低下造模的构建

SPF级大鼠36只，实验环境下适应性喂养7 d。按体质量随机分为4组，每组9只，分别为：NDC-I组[灌胃10.0 mg/(kg·d)非变性大分子胶原]、SA组[阳性对照组，灌胃0.42 mg/(kg·d)脾氨肽，人用量等效剂量6.3倍]、MC组（模型对照组，灌胃等体积蒸馏水）、NC组（正常对照组，灌胃等体积蒸馏水）。连续灌胃30 d，每天1次。

在实验的第24天和第25天，除NC组，给予等量生理盐水腹腔注射外，其它各组给予环磷酰胺[40 mg/(kg·d)]腹腔注射，共2次。实验第30天取材，进行指标检测。实验期间大鼠自由饮水摄食。

1.2.2 白细胞计数、分类和血清中免疫活性物质测定

异氟烷麻醉后，SD大鼠经腹主动脉取血，EDTA管收集血液，使用血细胞分析仪检测白细胞计数和白细胞分类。促凝管收集血液，静置2 h后，3000 r/min离心10 min，取上清液测定血清中IgA、IgG、IL-2、IL-4、IL-10、γ-IFN、TNF-α含量，具体操作按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.2.3 胸腺和脾脏指数、LDH活性和组织形态观察

大鼠处理前称体质量，解剖后取脾脏和胸腺，迅速用PBS缓冲液多次漂洗干净，滤纸吸干，分别称脏器质量。脏器指数为脏器质量与大鼠体质量的比值[21]。称取200 mg组织，匀浆后取上清，按照ELISA试剂盒说明书方法进行LDH活性检测。剩余脾脏和胸腺组织切块，置于4%多聚甲醛溶液常温固定后进行石蜡包埋、切片和苏木精-伊红染色，镜下观察组织病理变化。

1.2.4 统计学分析

实验数据采用IBM SPSS Statistics 25.0进行数据处理，计量数据资料采用±s表示；两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用ANOVA方差分析，p＜0.05表示具有统计学差异，p＜0.01表示具有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 NDC-I对体重和免疫器官指数的影响

脾脏和胸腺是机体重要的免疫器官。胸腺是T淋巴细胞分化和成熟的中枢免疫器官，可接受抗原刺激，产生免疫应答。脾脏是机体最大的免疫器官，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心。当机体接受抗原刺激后，T淋巴细胞及B淋巴细胞数目增多，相应细胞区体积扩大，免疫器官的体积和重量也随之增大[22-24]。由表1和表2可知，NDC-I干预前（实验第0天）至造模前（实验第24天）各组之间体重无显著性差异（p＞0.05）。腹腔注射环磷酰胺后（实验第30 d），模型组体重显著降低（p＜0.05），并且胸腺指数和脾脏指数也显著下降（p＜0.01）；与模型组比较，阳性对照组和NDC-I组大鼠的体重无显著差异，阳性对照组的胸腺指数和脾脏指数略有升高，差异不显著（p＞0.05），NDC-I组胸腺指数上升（p＜0.05），脾脏指数具有升高趋势（p＞0.05）。结果表明，经环磷酰胺诱导的免疫低下模型大鼠体重、胸腺指数和脾脏指数显著降低，NDC-I对大鼠胸腺损伤具有一定的修护作用。

表1 NDC-I对免疫低下大鼠体重变化的影响（¯x±s，n=9） Table 1 Effect of NDC-I on weight change of immunocompromised rats

表2 NDC-I对大鼠免疫器官指数的影响（¯x±s，n=9） Table 2 Effects of NDC-I on immune organic index of rats

2.2 NDC-I对白细胞计数和分类的影响

白细胞计数也可以在一定程度上反映机体非特异性免疫水平。腹腔注射环磷酰胺后，模型组白细胞计数、淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值、嗜酸粒细胞绝对值、嗜酸粒细胞百分数、嗜碱粒细胞绝对值和嗜碱粒细胞百分数显著下降（p＜0.01），中性粒细胞绝对值和单核细胞百分数下降（p＜0.05），说明环磷酰胺破坏了免疫系统，引起了机体免疫功能低下。与模型组比较，NDC-I组在预防性干预后白细胞计数显著上升（p＜0.01），且效果优于阳性对照组。

表3 NDC-I对大鼠白细胞计数和分类的影响（x¯±s，n=9，109/L） Table 3 Effects of NDC-I on white blood cell count and classification of rats

2.3 NDC-I对血清中免疫活性物质的影响

血清中的免疫球蛋白的含量和辅助性T细胞（Th细胞）分泌的细胞因子水平可以反映机体的体液免疫功能状态[25,26]，因此在本次实验中，选取血清中的IgA、IgG、IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ等7种免疫活性物质，作为反映机体免疫状态的指标。

IgG是人血清中含量最丰富的蛋白质之一，是体液免疫的主要抗体，约占血清免疫球蛋白总量的80%；而IgA源于肠系膜淋巴组织中的浆细胞，它主要进行局部免疫，其含量仅次于IgG，约占血清免疫球蛋白总量的10～20%[27]。模型组IgA、IgG的含量显著低于对照组（p＜0.01）；经过NDC-I预防性干预后，NDC-I组IgA、IgG的含量接近对照组且显著高于模型组（p＜0.01），效果优于阳性对照组（图1a、图1b）。本研究中，模型组大鼠血清IgA、IgG含量降低，并在NDC-I预防性干预后得到恢复。提示NDC-I可能通过恢复IgA、IgG含量来增强机体的体液免疫。

众所周知，环磷酰胺是一种使用广泛的细胞毒性药物，普遍应用于肿瘤的治疗中，可对骨髓的功能产生抑制作用，通过抑制免疫器官的功能并造成体重下降，使白细胞数量降低，其代谢产物通过交联作用使DNA和蛋白质烷基化，从而产生免疫功能的抑制[28,29]。Th细胞是重要的免疫调节细胞，根据细胞因子和功能的不同，分为Th0、Th1、Th2和Th3亚群，而Th1和Th2细胞及其分泌的细胞因子决定了免疫系统的功能。其中，Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ等Ⅰ类细胞因子，参与细胞免疫应答[30,31]，IFN-γ是特异性免疫的调节剂，能诱导Th0型细胞分化成Th1型细胞，并且能激活巨噬细胞、细胞毒性T细胞和清除胞内病原体[32]。而Th2细胞主要分泌IL-4，IL-10等Ⅱ类细胞因子，在介导体液免疫应答方面发挥着重要作用[33]。同时，TNF-α作为主要的免疫调节因子，不仅能够启动免疫调节、促进免疫细胞的活性，还具有抗恶性肿瘤、抗病毒、凝血和造血等多种重要的生物学作用[34]。结果显示，模型组中TNF-α、INF-γ、IL-2、IL-4和IL-10含量均显著低于对照组（p＜0.01）。经过NDC-I预防性干预后，NDC-I组TNF-α、INF-γ、IL-2、IL-4和IL-10的含量显著高于模型组（p＜0.01）（图1c～1g）。前期文献报道，环磷酰胺可导致大鼠免疫球蛋白和Th细胞分泌的细胞因子水平显著降低，而NDC-I不仅可提高机体内免疫球蛋白的含量，而且可以显著提高免疫低下大鼠血清中细胞因子（TNF-α、IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10）水平，推测NDC-I可能通过影响细胞因子的分泌，维持Th1/Th2的平衡，进而达到改善机体的免疫功能的作用。

2.4 NDC-I对脾脏和胸腺中LDH活性的影响

LDH是巨噬细胞活力的标志酶之一，其活性反映了巨噬细胞的活化能力和非特异性免疫水平[35]。实验结果显示，模型组脾脏和胸腺中LDH的活性均显著低于对照组（p＜0.01）；经NDC-I干预结束后，NDC-I组脾脏和胸腺中LDH的活性均显著高于模型组（p＜0.01）。LDH活性不仅直接影响细胞内糖酵解释放能量的速率，而且在催化糖酵解的过程中会产生大量的乳酸，从而引起巨噬细胞胞内pH值下降，有利于巨噬细胞胞内免疫活性物质和免疫功能的应答[36]。环磷酰胺显著降低了胸腺和脾脏中的LDH活性，而摄入NDC-I使得LDH活性显著提高，说明NDC-I能够减轻环磷酰胺对LDH活性的抑制作用，提高巨噬细胞活力。

2.5 NDC-I对脾脏和胸腺组织形态学的影响

脾实质是由白髓、红髓组成。由图3可以看出，对照组（图3a）的脾脏结构完整，红髓、白髓分界清晰，二者比例正常，淋巴小结较大，淋巴细胞排列紧密。模型组（图3b）脾脏白髓面积下降，红髓面积增加，淋巴小结减小，淋巴细胞数量明显下降，说明脾脏发生损伤。SA组（图3c）和NDC-I组（图3d）大鼠脾脏的白髓面积有所提高，红髓和白髓分界更加清晰，淋巴细胞数量明显增加，其病理损伤有所减轻。以上结果说明，NDC-I在一定程度上能够恢复环磷酰胺导致的脾脏损伤，对免疫器官有较为明显的修护作用。

胸腺小叶是由皮质、髓质组成。由图4可以看出，对照组（图4a）胸腺形态清晰，状态良好，淋巴细胞排列紧密。模型组（图4b）胸腺淋巴细胞排列变得疏松，密度下降，说明胸腺免疫功能下降。SA组（图4c）和NDC-I组（图4d）均能提高淋巴细胞数量，淋巴细胞分布更加紧密，一定程度上改善了病理性损伤。说明NDC-I在一定程度上能够恢复环磷酰胺导致的胸腺萎缩，对免疫器官有较为明显的修护作用。

脾脏和胸腺是机体主要的2个免疫器官，脾脏是机体细胞免疫和体液免疫的中心，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞。胸腺是T淋巴细胞分化和成熟的场所，通过接受抗原刺激产生免疫应答，胸腺和脾脏指数能够反映机体的免疫功能。在本实验中NDC-I使环磷酰胺所致的胸腺及脾脏指数明显升高；同时，组织形态学观察结果表示，NDC-I在一定程度上能够恢复环磷酰胺导致的脾脏和胸腺损伤。上述实验结果表明，摄入NDC-I对环磷酰胺所致免疫低下大鼠的免疫器官均有较显著的改善作用。

3 结论

本实验探究了NDC-I对环磷酰胺诱导的免疫力低下大鼠的免疫调节作用。实验结果显示通过连续30 d给予NDC-I后，大鼠的白细胞计数显著上升，脾脏指数和胸腺指数均增加，脾脏和胸腺组织病理学损伤减轻，表明NDC-I对环磷酰胺引起的免疫器官损伤具有一定的修护作用。同时，NDC-I能显著提高环磷酰胺导致的免疫低下大鼠体内免疫球蛋白和辅助性Th细胞分泌的细胞因子，提高LDH活性，影响机体胞内细胞糖酵解释放能量的速率，进而可能对巨噬细胞胞内免疫活性物质的释放和免疫功能的应答具有促进作用。综上所述，适量摄入NDC-I对环磷酰胺所致免疫低下大鼠的多项免疫功能均有较显著的改善作用，而关于NDC-I免疫调节的作用机制还需进一步实验探究，以期为NDC-I的综合开发和利用提供新的研究思路。