细胞内镜评估结直肠病变的研究进展

2022-06-29马鸣扬王洁玮

首都医科大学学报 2022年2期

马鸣扬王洁玮李鹏

(首都医科大学附属北京友谊医院消化内科，北京 100050)

在过去二十年间，消化内镜技术已经从普通白光内镜向放大内镜方向深入发展。细胞内镜(endocytoscopy，EC)作为近年来新兴的放大内镜技术，可以提供超高倍观察图像。配合染色及窄带成像技术，内镜医师通过肉眼即可对结直肠病变进行组织、细胞以及微血管的形态学判断，从而实现在体实时活检的目的[1-2]。EC系统评估结直肠病变的研究目前主要来源于日本及欧美国家，其中对于结直肠浸润性肿瘤、息肉、炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的评估展现了EC诊断准确性高、病理结果等待时间短等优势[3-5]。本文旨在对EC评估结直肠病变的研究进展进行综述。

1 EC硬件发展

自2003年至今，EC已更新至第四代。随着不断增长的内镜观察需求及技术上的进步，EC由最初的定焦探针式发展为如今可变焦的集成内镜式，放大倍数也从450倍增长至520倍[6-7]。第一代EC为两种模型机(PrototypeⅠ和Ⅱ)，诞生于2003年，二者均为探针型，从普通肠镜的活检孔道中插入进行观察，放大倍数及视野分别为450倍、1 125倍，300 μm×300 μm、120 μm×120 μm[6]。Prototype Ⅱ虽放大倍数高于Ⅰ，但观察病变深度浅，视野小。第二代EC(XCF-260EC1)为集成内镜式双镜头EC，定焦放大450倍，视野400 μm×400 μm，观察深度50 μm。第三代EC(CF-Y0020-1)为集成单镜头EC，放大倍数从80倍连续变焦至380倍，观察视野700 μm×600 μm。最新第四代EC为集成内镜，放大倍数达520倍，观察深度为35 μm[8]。

2 EC检查前准备

染色对于EC检查至关重要，良好的染色可凸显细胞核、组织及腺腔的形态，从而增强观察效果，应用最广泛的染色方法为0.05%(质量分数)结晶紫+1%(质量分数)亚甲蓝双染法(CM双染法)[3]。Ichimasa等[9]研究发现CM双染法优于单独使用亚甲蓝进行染色，整个染色过程持续约1 min，用水冲去浮色，避免过度染色，可使细胞及细胞核形态充分展现。此外，窄带成像(narrow-band imaging，NBI)被称为虚拟染色技术，利用不同光束波长不同的原理，对反射光进行过滤，从而观察黏膜血管[10]。有研究[2]表明，将 NBI与EC结合，节省了染色时间，是在放大内镜窄带成像基础上的进一步发展，在超高倍放大图像下判断黏膜表面微小血管，为EC诊断提供了新思路。无论选取何种方法，使用EC观察结直肠病变时都需要将镜头与黏膜接触，从而得到清晰图像[6]。

3 EC诊断结直肠息肉及肿瘤

Sasajima等[6]对结直肠病变的EC图像特点进行了初步归纳。正常黏膜：腺体排列规则，形态一致，细胞核沿基底膜规则排列。增生性息肉(hyperplastic polyp，HP)：锯齿状腺体清晰。低级别腺瘤：管状腺体大小均匀，细胞密度低，梭形细胞核沿基底膜规则排列，极性稍紊乱。高级别腺瘤：腺体不规则地分支，出现细胞异型性，细胞核增大畸形、极性消失。浸润性癌：腺腔结构消失，细胞核明显增大畸形。Rotondano等[11]首次对EC图像进行分级：EC0a：规则圆腺腔；EC0b：规则锯齿状腺腔；EC1a：狭缝样腺腔伴纺锤状细胞核；EC1b：规则腺体，核大深染；EC2：腺体形状不一，核大畸形；EC3：腺体结构消失，核大畸形。Kudo等[12]总结EC图像特点后提出了较成熟的EC分级：EC1a：小而圆的腺腔伴正常纺锤形细胞核；EC1b：锯齿状腺腔伴颗粒状细胞核聚集；EC2：狭缝样腺腔伴略肿胀的纺锤形或圆形核；EC3a：不规则腺腔伴中度肿胀的深染细胞核；EC3b：腺体结构消失伴高度肿胀的异常细胞核聚集。其中，EC1a和EC1b代表非肿瘤性病变，EC2代表腺瘤或黏膜内癌，EC3a代表黏膜内癌或轻度浸润的黏膜下癌，EC3b代表广泛浸润的黏膜下癌或者更高级别的癌。在后续研究中，Kudo等[13]又对EC分级进行了补充(图1)，将EC3a分为低级别和高级别，对应的图像特征分别为：略增大的深染椭圆核，核分层略增多、轮廓分明；大量异常增大核，核分层明显增多，轮廓圆钝。Mori等[14]开展随机对照实验(randomized controlled trial，RCT)表明EC分级对肿瘤性病变诊断准确率达到94.1%(95%CI：87.6%～97.8%)，不亚于病理活检。

图1 Kudo EC分级[13]

Kudo等[2]将EC与NBI结合，根据结直肠黏膜表面微血管形态建立了EC-V分级：EC-V1：微血管形态正常且模糊，提示正常黏膜；EC-V2：微血管网密集且清晰，提示肿瘤性病变；EC-V3：微血管网杂乱且稀疏，提示浸润性癌。该分级对T1期结直肠癌、增生性息肉的诊断准确率分别达到88.6%和99.0%。EC-V分级与Pit pattern分型相比，诊断准确率差异无统计学意义，说明其在诊断结直肠黏膜表面病变时有较好表现。

息肉为结直肠常见病变，根据病理学可分为腺瘤性息肉和非腺瘤性息肉，其中，腺瘤性息肉为结肠癌癌前病变[15]，一旦发现应及时治疗。息肉恶变风险也与大小密切相关，当病变大于2 cm时癌变概率也会增加。一项对直径大于或等于5 mm的结直肠病变的随机研究[14]表明，细胞内窥镜的诊断准确率并不低于活检。目前内镜医师对于结直肠息肉均采取一刀切的处理方式，使没有癌变倾向的息肉和低级别腺瘤也被切除。为了探究EC评估良性息肉的准确性，Utsumi等[16]使用EC分级对微小息肉(≤5 mm)中腺瘤性息肉(EC2)和非腺瘤性息肉(EC1b)进行评估，结果表明，EC可以对二者进行在体实时评估，降低了病理学评估成本，减少了患者的痛苦及出血风险。Kataoka等[17]利用EC+NBI技术鉴别增生性息肉与腺瘤性息肉，发现EC下增生性息肉微血管较腺瘤更模糊，对此解释为增生性息肉微血管在更深层位置。Kudo等[18]使用第四代EC，对低级别腺瘤进行观察，发现正常腺体征(normal pit，NP)为其特有表现，可以借此与高级别腺瘤进行鉴别，从而避免活检对组织的创伤以及因反复取材导致的结缔组织增生，影响追加内镜黏膜下剥离术(endoscopic submucosal dissection，ESD)的进行。

广基锯齿状腺瘤/息肉(sessile serrated adenoma/polyp，SSA/P)在过去被认为是具有恶变倾向的增生性息肉，因镜下形态与增生性息肉相似而难以区分，其与传统锯齿状腺瘤(traditional serrated adenoma，TSA)均为癌前病变，一旦发现应及时处理[19]。Kutsukawa等[4]使用EC对687例锯齿状腺瘤的腺腔和细胞核形态特点进行归纳，与病理学结果对比，研究显示，EC下增生性息肉为星形腺腔伴小圆细胞核，SSA/P为卵圆形腺腔伴小圆细胞核，而TSA为锯齿状或绒毛状腺腔伴纺锤状胞核，但此研究并未明确定义腺腔开口大小。Ogawa等[20]发现腺腔扩张是SSA/P的特征之一，SSA/P和增生性息肉管腔横截面积的均值分别为4 152 μm2和2 117 μm2，受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析表明，管腔面积截止值为3 068 μm2，区分SSA/P和增生性息肉的灵敏度为80.0%，特异度为77.3%，准确度为78.0%，ROC曲线下面积为0.865。使用EC区分SSA/P与增生性息肉准确度较高，但花费时间也较长，平均评估时间为5 min。

对于恶变风险较低的幼年性息肉，Takeda等[21]将EC下观察结果与病理结果进行对照，总结出幼年性息肉四联症：微红表面、表面糜烂、隐窝开口扩张、隐窝密度降低。该发现有助于进一步研究幼年性息肉的发育倾向，为内镜下治疗提供参考。

黏膜下深层浸润结直肠癌(massive submucosal invasion cancer，SM-m)指肿瘤浸润超过1 000 μm的病变，伴淋巴转移的风险增加[22]，内镜下切除不能达到根治，应考虑追加外科手术扩大病变切除范围。因此，准确判断病变深度对于治疗方式及预后有重要意义。Kudo等[3]使用Pit pattern分型和EC分级对89例SM-m患者进行评估，诊断准确率为96.3%，高于单独使用Pit pattern分型的93.8%(P=0.004)。促结缔组织增生反应(desmoplastic reaction，DR)被认为是癌细胞从黏膜肌层向黏膜下深层侵袭的标志，检测有助于预测结直肠癌在黏膜下层的深浸润[23]。Sugihara等[24]发现通过EC发现的细颗粒结构(fine granular structure，FGS)可以提示DR，进而预警SM-m，准确度达87.3%。Sako等[25]结合病理对118个T1期结肠癌EC图像进行分析，发现镜下观察97.1%的腺体融合病变(fused gland formations on endocytoscopy，FGFE)的病理结果都出现了SM-m，与淋巴结转移密切相关，建议出现FGFE的患者行外科手术并清扫淋巴结。此外，Nakamura等[26]使用EC-V分级观察微血管，发现SM-m的病变特点为血管扩张，微血管网消失，血管直径改变，串珠征。在诊断癌变浸润深度方面，一项Meta分析[5]表明，使用EC优于Pit pattern分型，预示着EC比放大内镜更具潜力。

结直肠侧向发育性肿瘤分为颗粒型和非颗粒型，其中，非颗粒型中的假凹陷型黏膜下浸润倾向最高，应予以高度重视[27]。Kudo等[12]使用EC分级对非颗粒型侧向发育型肿瘤浸润深度进行评估，诊断准确率为90%。但当判断隆起型病变浸润深度时，效果不如Pit pattern分型，这可能是因为隆起性病变表层与深层距离较远，EC观察深度有限造成。

4 EC诊断炎症性肠病

内镜及组织病理学缓解是评价炎症性肠病治疗效果的重要指标，EC的出现使得在体实时观察病变而无需活检成为可能，Bessho等[28]提出溃疡性结肠炎的EC评分系统(endocytoscopy system score，ECSS)，从隐窝形状、相邻隐窝距离、血管可见度三方面对病变进行评估，研究表明，虽然该评分不能评估传统病理学中炎症细胞浸润等项目，但因其与组织病理学评分有良好的相关性，可以作为病理的简化替代标准。在另一项对40名IBD(其中，溃疡性结肠炎患者21例，克罗恩病患者19例)患者的初步研究[29]中，发现EC和肠道疾病活动的组织病理学Riley评分之间的一致性为100%，两名研究者之间观察水准近乎一致(Kappa = 0.76～0.88)。Nakazato等[30]选取内镜下愈合即Mayo内镜评分=0的64例患者，检测ECSS评估病理组织学缓解(Geboes病理组织学评分≤2)的诊断准确性，证明了ECSS可以用于评估溃疡性结肠炎患者的组织学愈合情况。另外，使用计算机辅助诊断(computer-aided diagnosis，CAD)系统可以全自动识别与溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)相关的EC图像，大大提高了检查的效率[31]。

最近有研究[32]表明，Mayo内镜下评分=1的溃疡性结肠炎也有较高复发率。Maeda等[33]使用EC观察了黏膜内血管及隐窝，对Mayo内镜下评分=1的患者进行评估，发现黏膜内毛细血管及隐窝活跃的溃疡性结肠炎患者有30.5%复发。

炎症性肠病随病程的延长可能出现癌变，因此发明新的检测方法，准确地在早期发现肿瘤性病变至关重要，虽然目前还没有相关文献报道EC诊断炎症性肠病伴癌变，但有研究[34]表明，异常隐窝灶是结直肠癌早期的先兆，或许能为在炎症性肠病中发现黏膜癌变提供参考。

5 EC的局限性

虽然EC在提供结直肠病变的实时病理诊断方面有重要作用，但仍有亟待解决的问题限制其发展。第一，因为放大倍数提高，内镜医师需要小心将镜头贴近黏膜表面并对焦，从而获得清晰图像，加上观察前使用染色剂染色，致使EC检查时间延长[8，35]。第二，EC目前的黏膜观察深度为50 μm，只能通过观察表面结构对浸润性病变做出判断[2]。最后，目前对于EC的研究大多为单中心回顾性，样本量较少。在实际工作中，还需要更多证据等级较高的EC分级方法指导诊断及治疗。