紫甘蓝花青素/大豆分离蛋白复合膜的制备与性能研究*

陈成，李蕾，毕会敏，范方宇

(1.西南林业大学 林学院，云南 昆明 650224；2.西南林业大学 生命科学学院，云南 昆明 650224)

大豆分离蛋白(soy protein isolate,SPI)作为一种优质蛋白，含有90%以上的蛋白质[1]。大豆分离蛋白作为制备可食用食品包装膜的成膜基质，具有来源广泛、价格低廉、环境友好以及成膜性好等优点[1-3]。但纯大豆分离蛋白膜存在阻隔性弱、稳定性差、易溶于水等不足[4]。近年来，已有不少学者对大豆分离蛋白进行改性或添加天然材料的方法改善大豆分离蛋白膜的缺陷[5]。

花青素是自然界中一类广泛存在于植物体内的类黄酮物质，使植物呈现各种颜色[6-7]。花青素在不同pH环境下结构不同，当pH小于3，花青素主要以红色的黄烊盐离子为主，pH大于7时花青素转换为蓝色的醌式碱[8]。目前，已有学者根据这一特点，将花青素添加到不同成膜基质中以研究花青素对复合膜性能的影响，并探讨其在食品保鲜色敏指示领域的应用[9-13]。冉锐敏等[2]以葡萄皮红、纳米氧化锌和大豆分离蛋白为原料制备复合膜，发现葡萄皮红的添加可提高纳米氧化锌和大豆分离蛋白的相容性，同时葡萄皮红能与纳米氧化锌发挥协同作用增强大豆分离蛋白膜机械性能、耐水性能和热稳定性。Liu等[14]研究紫甘蓝花青素添加量对羧甲基纤维素钠/聚乙烯复合膜pH敏感性和物理性能方面的影响，发现花青素能增强羧甲基纤维素钠和聚乙烯的相容性，较低添加量的花青素复合膜对猪肉新鲜度检测比较高花青素添加量复合膜更敏感。封晴霞等[15]以蓝莓花青素为新鲜度指示剂，与玉米淀粉和羧甲基纤维素制成混合膜，发现蓝莓花青素与两种成膜基质相容性良好，且复合膜能很好地应用于牛肉鲜度检测中。

紫甘蓝(Brassicaoleraceavar.capitataf.rubra)作为十字花科(Cruciferae)农作物的一种，在我国大部分地区均有种植[16]。本文从紫甘蓝中提取花青素，以大豆分离蛋白为基材，探究不同紫甘蓝花青素添加量对大豆分离蛋白复合膜阻隔、机械、热稳定性能的影响，利用扫描电镜(SEM)、傅里叶红外光谱(FTIR)、X-射线衍射仪(XRD)、差示量热扫描仪(DSC)对膜进行分析表征，并研究复合膜对不同pH环境的色敏性，以期为紫甘蓝花青素制备新型指示膜的研发和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

紫甘蓝购于云南省昆明市农贸市场；大豆分离蛋白购于德州谷神蛋白科技有限公司，食品级；柠檬酸、氢氧化钾等均为分析纯。

JHY-5000电子万能试验机，厦门金河源；IRPrestige-21傅里叶红外光谱仪，日本导津；UV-2600紫外分光光度计，苏州岛津；D8 Advance X-射线衍射仪，德国布鲁克；MIRA4扫描电镜，捷克泰思肯；DSC204F1差示量热扫描仪，德国耐驰；FD5-3冷冻干燥机，美国金西蒙。

1.2 试验方法

1.2.1 紫甘蓝花青素制备

紫甘蓝预处理 紫甘蓝去除最外层皮、梗，蒸馏水洗净，50 ℃干燥36 h，粉碎过60目筛，收集筛下样品，4 ℃避光保存备用。

紫甘蓝花青素提取 紫甘蓝粉按料液比1∶3(g/mL)加入0.3%柠檬酸与95%乙醇的混合溶液(1:2，v/v)于50 ℃水浴浸提3 h，抽滤，45 ℃旋蒸浓缩后冻干，得紫甘蓝花青素(PCA)。

1.2.2 PCA/SPI复合膜制备

称取6.00 g大豆分离蛋白、2.40 g丙三醇倒入装有100 mL蒸馏水的烧杯中，溶解后置于恒温水浴磁力搅拌锅内以80 ℃、500 r/min水浴50 min，冷却至室温后加入一定量PCA，500 r/min水浴10 min取出，300 W超声10 min进行消泡，得成膜液。成膜液缓慢倒于光滑塑料培养皿上，流延成膜，50 ℃干燥24 h后置于温度为25 ℃、湿度为50%的恒温恒湿箱内平衡48 h，揭膜。为研究PCA添加量对复合膜物理性能的影响，PCA添加比例为0%、5%、10%、15%、20%(w/w)。

1.3 性质测定

1.3.1 透O2速率

复合膜透O2速率按照文献[17]的方法进行测定。

1.3.2 透CO2速率

40 mm × 25 mm称量瓶内放入5.00 g KOH，用复合膜密封瓶口，石蜡密封。称重后放于温度为25 ℃、湿度为50%的恒温恒湿箱内7 d(168 h)，称重并计算质量差。复合膜透CO2速率依下式计算。

式中：QCO2为复合膜透CO2速率〔g/(m2·d)〕；Pm为测试时间内称量瓶的质量差(g)；J为密封称量瓶口的复合膜面积(1.26×10-3m2)；T为测试时间(d)。

1.3.3 透水蒸气速率

40 mm × 25 mm称量瓶内放入5.00 g CaCl2，用复合膜密封称量瓶口，石蜡密封。称重记录，放于温度为25 ℃、湿度为50%的恒温恒湿箱内7 d，称重并计算质量差。复合膜透水蒸汽速率依下式计算。

式中：WVP为复合膜透水蒸气速率〔g·mm/(m2·d·kPa)〕；Pm为测试时间内称量瓶的质量差(g)；h为复合膜厚度(mm)；J为密封称量瓶口的复合膜面积(1.26×10-3m2)；T为测试时间(d)；Δp为复合膜两侧水蒸汽压差(kPa)。

1.3.4 不透明度

复合膜不透明度按照文献[8]的方法进行测定。复合膜裁剪成10 mm × 20 mm，放于空比色皿内，以空比色皿为空白对照试验组，测定复合膜吸光度值。复合膜不透明度按下式计算。

式中：C为复合膜不透明度(%)；A600为复合膜在600 nm处的吸光度值；h为复合膜厚度(mm)。

1.3.5 机械性能的测定

复合膜机械性能按照文献[17]的方法进行测定。机械性能包括断裂伸长率(TS)和拉伸强度(EB)。

1.3.6 扫描电镜分析方法

采用扫描电镜(SEM)观察复合膜微观形态结构。观察复合膜截面时使用液氮对复合膜进行脆断，样品喷金，观察倍数10 000倍。

1.3.7 傅里叶红外光谱分析方法

采用傅里叶红外光谱分析复合膜官能团。KBr压片法制样，取一定量样品与KBr混合研磨后压片，扫描范围4 000～500 cm-1。

1.3.8 X-射线衍射分析方法

采用X-射线衍射分析仪对复合膜晶体结构进行分析。衍射角2θ范围为5～80°，扫描速度为5°/min。

1.3.9 差示量热扫描仪分析方法

采用差示量热扫描仪分析复合膜热稳定性。空坩埚为对照组，氮气流速20 mL/min，升温速率10 ℃/min，扫描温度60～200 ℃。

1.3.10 花青素pH敏感性测定

为验证PCA对pH的敏感性，将PCA配制成质量分数为10%的溶液，配制好的花青素溶液以1︰2(v/v)的比例加入到不同pH(3、4、5、6、7、8、9、10、11)缓冲溶液中，充分摇匀混合溶液后放于暗处静置15 min，观察混合溶液颜色变化并拍照记录。

1.3.11 PCA/SPI复合膜色敏响应

为验证PCA/SPI复合膜对pH变化的敏感性，将复合膜裁剪成40 mm × 40 mm，浸没于不同pH(3、4、5、6、7、8、9、10、11)缓冲溶液中，复合膜颜色发生变化后用镊子取出放于干净玻璃培养皿内，50 ℃干燥12 h，观察PCA/SPI复合膜颜色变化并拍照记录。

2 结果与分析

2.1 阻隔性能分析

阻隔性能是判定膜对食品保鲜程度的指标，阻隔性能越好说明膜对食品具有较高的保鲜性能，复合膜阻隔性能主要包括透O2、透CO2和透水蒸气[18]。

图1为不同PCA添加量对复合膜阻隔性能的影响。与空白对照组(PCA添加量为0%)相比，添加PCA对复合膜透O2、透CO2率影响显著(P<0.05)，当PCA添加量为10%时，复合膜透O2、透CO2率最低。这可能是因为PCA加入SPI成膜基质后，PCA与SPI之间形成的作用力使复合膜变为致密的结构，延长气体在复合膜中的迁移路径，使得复合膜阻隔性能降低。PCA添加量较少时，所形成作用力无法阻隔大量气体透过；但当PCA添加量超过10%后，由于添加PCA量过多，导致SPI成膜基质与PCA之间的氢键被破坏，使气体阻率降低[17,19]。

水蒸气透过率(WVP)是衡量复合膜隔绝空气中水分的指标，WVP越低说明复合膜隔绝空气中水分的能力越强，对食品的保鲜效果越好[20]。图1b可知，复合膜WVP随PCA添加量呈现先降后增的趋势，PCA添加量为15%的复合膜WVP值最低。这主要是因为SPI具有较高的亲水性，因此PCA添加量为0%(纯SPI膜)的WVP值最高，添加PCA后，纯SPI膜透水性能得到改善使复合膜形成较为致密的结构从而阻隔更多水分。

2.2 不透明度分析

不透明度是衡量复合膜作为食品包装膜的另一重要指标，不透明值越高，复合膜阻隔光的能力就越强，对食品的保鲜能力也越强[21]。

图2为PCA添加量对复合膜不透明度的影响。PCA添加量从0%增至20%，PCA/SPI复合膜不透明度从74.12%增至124.02%，这是由于PCA添加量的增加填补了SPI基质中的孔隙，PCA与SPI形成结构更为致密的复合膜，阻碍光通过，同时PCA自身对于紫外光具有较好阻隔性能，使PCA/SPI复合膜不透明度与PCA添加量呈正相关关系[7,22]。

图2 不同紫甘蓝花青素添加量对复合膜不透明度的影响

2.3 机械性能分析

机械性能是衡量食品包装膜的重要指标，机械性能较好的食品包装膜在运输和储存过程中能对食品起到较好的保护作用[15,19]。图3为不同PCA添加量对PCA/SPI复合膜机械性能的影响。复合膜机械性能随PCA添加量的增加呈现先增后减的趋势且复合膜在PCA添加量为15%时具有较好的机械性能。PCA/SPI复合膜TS和EB分别从0%PCA添加量的1.44 MPa、64.67%增至15%PCA添加量的2.14 MPa、129.38%。这可能是因为添加PCA后，PCA与SPI均匀混合形成致密结构，提升复合膜机械性能，但当PCA添加量超过15%时，过量的PCA会使SPI蛋白网络结构中键合作用减弱，加之PCA自身团聚从而使复合膜机械性能降低。

图3 不同紫甘蓝花青素添加量对复合膜机械性能的影响

2.4 扫描电镜分析

通过扫描电镜(SEM)分析复合膜表面、截面结构，复合膜表面、截面越粗糙说明PCA与SPI之间的相容性越差[23]。图4为不同PCA添加量复合膜表面、截面扫描电镜。SPI膜(0%PCA添加量)表面不平整，存在许多小团粒和空隙。随着PCA添加量增加，膜内空隙逐渐减少，当PCA添加量超过15%时，复合膜表面SEM图出现细小孔隙和颗粒。这主要是因为PCA能填充SPI蛋白质网络结构，使得复合膜内部空隙减少，结构致密，同时PCA中羟基与SPI中的羟基形成分子间氢键，使复合膜机械性能和相容性得到改善。但PCA添加量为20%时，由于SPI自身的团聚作用，PCA添加量越大，与SPI之间的相容性越差，导致复合膜存在许多细小孔隙。通过图4(b)复合膜截面SEM图可知，当PCA添加量超过15%时，复合膜出现细小颗粒，说明添加过量花青素会使PCA与SPI之间的相容性变差，出现SPI团聚，降低复合膜的机械性能[15]。这与之前复合膜阻隔性能、机械性能解释一致。

(a) 复合膜表面SEM图(b) 复合膜截面SEM图

2.5 傅里叶红外光谱分析

图5为不同PCA添加量复合膜的傅里叶红外光谱(FTIR)图。与空白膜相比，PCA/SPI复合膜未出现新的特征峰，说明添加PCA未改变膜的化学性质。SPI、PCA、PCA/SPI复合膜的O-H伸缩振动分别在3 466 cm-1、3 322 cm-1和3 292 cm-1处，复合膜O-H伸缩振动峰向右偏移，说明PCA和SPI之间为物理结合且复合膜中PCA和SPI分子间存在氢键相互作用[25]。PCA/SPI复合膜C-H伸缩振动峰在2 958 cm-1处，与2 871 cm-1处SPI的C-H伸缩振动相比向左发生偏移，说明添加PCA后对复合膜C-H有明显影响作用。复合膜C=O伸缩振动峰在1 637 cm-1处，N-H弯曲的吸收峰分别在1 538 cm-1和1 260 cm-1处[1,5]。以上结果说明PCA和SPI之间具有较好的相容性。

图5 不同紫甘蓝花青素添加量复合膜红外光谱

2.6 X-射线衍射分析

通过X-射线衍射(XRD)分析不同PCA添加量对复合膜晶体结构和相容性的影响，出现高而窄的衍射峰表明样品结晶度高，低而宽的衍射峰则说明样品结晶度低[14]。PCA、SPI和纯SPI膜在2θ为16.6°处有一高而窄的衍射峰，此外29.1°处还有一较弱衍射峰，这说明PCA、SPI和纯SPI膜结晶性高[7]。添加PCA后，复合膜在2θ为9.1°处的衍射峰消失，仅在2θ为26.6°时存在较弱衍射峰，说明PCA与成膜基质之间相容性良好，同时PCA和SPI中的氢键形成范德华力使复合膜结晶性减弱[7]。

图6 不同紫甘蓝花青素添加量复合膜XRD光谱图

2.7 差示量热扫描仪分析

通过样品在监测温度范围内出现的吸热峰分析样品熔融温度[19,25]。由图7可知，与SPI相比，纯SPI膜热稳定性较差，添加PCA可提高复合膜熔融温度。纯SPI膜熔融温度为87.26 ℃，当PCA添加量为15%时，复合膜熔融温度最高，为138.47 ℃。这可能是因为添加PCA后SPI和PCA分子之间形成了强烈的分子间作用力，需要更多的热能对这些作用力进行解离。PCA添加量较少时，PCA与SPI之间形成的作用力较弱，所需热能也较少；结合SEM可以看出PCA添加过量时，花青素与大豆分离蛋白复合膜表面分布不均影响复合膜结构的稳定性，使20%PCA添加量复合膜的熔融温度下降至101.84 ℃。在食品材料包装中，提高复合膜热稳定性可延长食品货架期。

图7 不同紫甘蓝花青素添加量对复合膜热性能的影响

2.8 复合膜pH值响应性分析

图8a为PCA在pH3～11环境下的显色响应。当pH为3时，PCA为亮红色，pH为4～7时，PCA由亮红色变为浅红色，pH为8时，PCA为紫色，随着溶液环境碱性增大，PCA从浅绿变为深绿。这主要是由于花青素的四种结构在不同酸碱环境下引起的变化[15]。当花青素在pH为2～3的环境中时，其主要以红色的黄烊盐离子为主，随着pH值的增加，花青素中阳离子与OH-离子结合后形成无色甲醇假碱，红色逐渐变淡，当pH大于8后，花青素部分结构在碱性条件下极不稳定，发生去质子反应，使PCA逐渐呈现蓝绿色[11]。

图8b为不同PCA添加量复合膜在pH3～11环境下的显色响应。各PCA添加量复合膜在pH3～11环境下颜色变化趋势大致相同，均由酸性条件下的红色逐渐变为浅红最后变为绿色，这与PCA在不同pH环境下的显色响应变化一致，但与PCA本身颜色存在一定差异。PCA添加量为15%时，复合膜颜色响应变化最为明显。以上分析表明，以15%PCA添加量制备的复合膜对pH反应敏感，可以通过复合膜颜色变化对食品鲜度进行监测。

(a) PCA(b) PCA/SPI复合膜

3 结论

本文研究PCA添加量对紫甘蓝花青素/大豆分离蛋白复合膜性能及其对pH色敏性的影响。结果表明，15%PCA添加量的复合膜在机械性能、阻隔性能方面均有较好表现；复合膜不透明度随PCA添加量增加呈现上升趋势；SEM分析表明，PCA与成膜基质之间相容性较好；FTIR分析表明，添加PCA后复合膜化学结构未发生改变；XRD分析表明，添加PCA会降低复合膜结晶度；DCS分析表明，PCA添加量为15%时的复合膜热稳定性最好，熔融温度为138.47 ℃。通过PCA和复合膜pH响应性分析表明，花青素和复合膜在pH3～11环境下的变化趋势一致，过程为亮红色—浅红色—紫色—浅绿—深绿，同时15%PCA添加量复合膜在不同pH环境下颜色变化最敏锐。