Lnc-CRCMSL在结直肠癌中的表达及对癌细胞生长的影响

赵 倩， 杨振威， 刘亚萍， 卢桂芳， 和水祥， 李雅睿， 张志勇， 任牡丹

(1.西安交通大学第一附属医院消化内科，陕西省西安市710000；2.西安市中心医院消化内科，陕西省西安市710000)

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是最常见的消化系统肿瘤，饮食习惯、炎症、基因突变等因素均可导致结直肠癌的发生。尽管CRC的治疗和分子机制的研究有了重要进展，但其治愈率仍然相对较低[1-2]。目前，化疗已广泛应用于癌症治疗，如5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是CRC治疗的首选抗癌药物，但肿瘤细胞产生耐药性是限制化疗疗效的主要问题，而耐药性产生的原因尚未完全明确[3]。长链非编码RNA(lncRNA)是一种具有重要生物学功能的RNA，可通过多种方式发挥对细胞的调控作用，并在癌症的发生发展及抑制肿瘤中发挥着重要作用[4]。本文探讨Lnc-CRCMSL在结直肠癌中的功能作用，并为顺铂耐药CRC的治疗提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

收集2018年2月—2019年9月本院经病理证实的结直肠癌90例，以及来自同一患者的邻近正常结肠组织30例为对照组。结直肠癌组织样本按TNM分期包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期各30例。人结直肠癌细胞系(HCT116、HCT8、HT29、SW480)和人类胎儿结肠(human fetal colon,FHC)细胞系均购自美国American type culture collection(ATCC)细胞库。

1.2 细胞培养和转染

将CRC细胞系HCT116、HCT8、HT29、SW480和正常FHC细胞系以及顺铂耐药SW480/DDP细胞置于DMEM培养基中，辅以10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素在37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，培养液每隔3～5天调换1次。亲代SW480细胞持续暴露于含有顺铂培养基中12个月，顺铂质量浓度从0.5 mg/L增加直到细胞获得10 mg/L的耐药性。实验前，SW480/DDP细胞需在DMEM培养基(无药物)中持续传代培养2周，根据细胞状态调整顺铂质量浓度，获得状态良好、稳定传代的细胞系。克隆Lnc-CRCMSL慢病毒载体(Lnc-CRCMSL过表达组)和相应的阴性对照(阴性对照组)，转染前，在细胞达到30%融合度的1天后将其接种在6孔板上。细胞转染使用Invitrogen Lipofectamine®2000(美国Thermo Fisher Scientific,Inc.)，按照操作说明书进行。

1.3 qRT-PCR测定Lnc-CRCMSL表达水平

采用TRIzol试剂(Invitrogen，美国)从转染细胞中分离总RNA，使用DNaseI(Promega，美国)处理。使用MultiscribeRTkit(Applied Biosystems,USA)和oligo(dT)进行反转录。扩增体系：PCR反应包含2 μL cDNA、0.4 μL正向引物、0.4 μL反向引物、7.2 μL H2O2和10 μL SYBR；扩增条件为95 ℃30 s,95 ℃5 s,60 ℃30 s,循环40次。采用2-ΔΔCt法计算表达水平，GAPDH作为实验内参。Lnc-CRCMSL正向引物：5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′,反向引物:5′-GGATCCTCCACTAGTGATTTCACT-3′；GAPDH正向引物：5′-CATCAAGAAGGTGGTGAAG CA-3′,反向引物:5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′。

1.4 流式细胞术测定细胞的凋亡率

采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(北京比奥生物科技有限公司，中国)进行凋亡分析，鉴定并量化凋亡细胞。细胞被接种到6孔板上，然后用冷却的PBS洗涤2次，在缓冲液中复苏。贴壁细胞和漂浮细胞按照说明书进行处理，用流式细胞仪(Beckman Coulter,USA)检测，以区分凋亡细胞和坏死细胞。

1.5 CCK-8测定细胞的增殖活力

使用胰酶消化生长旺盛的待测细胞，制备成5×107个/L的细胞悬液，置于96孔培养板，每孔内含有100 μL细胞悬液。放入5%CO2培养箱，孵育72 h，然后每孔添加20 μL 5 g/L MTT溶液，孵育2 h，再缓慢取出培养液，添加DMSO 200 μL，震荡15 min，检测各孔光密度。重复3次，计算细胞存活率。

1.6 划痕愈合试验测定细胞的迁移能力

在6孔板中均匀接种稳定转染的SW480/DDP细胞，每孔5×105个细胞数。用20 μL移液器枪头建立细胞划痕，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗6孔板，去除刮起的漂浮细胞，每孔加入2 mL无血清DMEM。培养48 h后在显微镜下观察细胞迁移情况并拍照。

1.7 Trasnwell测定细胞侵袭能力

采用涂有基质胶基质的Transwell室(Corning，Inc.，Corning，New York，US)，收集细胞并将其重悬于培养基中(1×105个细胞/mL)。随后，将细胞悬浮液(200 μL)加入上室，并将补充有20%FBS(500 μL)的培养基加入下室。在37 ℃温育24 h后，将浸入基质胶的细胞固定，染色并计数。

1.8 免疫蛋白印迹测定MMP2和MMP9的蛋白表达

采用RIPA裂解缓冲液(Beyotime Biotechnology，中国)和蛋白酶抑制剂(Roche，中国)提取所用蛋白。使用BCATM蛋白分析试剂盒(Pierce，美国)对蛋白进行定量分析。取相同量总蛋白上样，经10% SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上，在37 ℃下用5%脱脂乳封闭1 h，在4 ℃下用以下抗体孵育过夜。基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)和GAPDH的相关抗体购自武汉三阳生物技术有限公司。PVDF膜用TBS洗涤3次，室温孵育2 h，采用Fusion FX5图像分析系统进行分析。

1.9 统计学分析

2 结 果

2.1 Lnc-CRCMSL在结直肠癌组织和细胞中的表达情况

Lnc-CRCMSL在CRC组织中表达量低于正常癌旁组织，且在Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌组织中的表达量低于Ⅰ期(P<0.05；图1A、B)。Lnc-CRCMSL在结直肠癌细胞系(HCT116、HCT8、HT29、SW480)中的表达量低于正常结肠上皮细胞系(P<0.05；图1C)。

图1 Lnc-CRCMSL在结直肠癌组织和细胞中的表达情况

2.2 结直肠癌耐药细胞SW480/DDP的建立与鉴定

在SW480和耐药细胞系SW480/DDP中检测Lnc-CRCMSL表达，qRT-PCR分析表明，SW480/DDP细胞系中Lnc-CRCMSL表达水平明显降低(P<0.05；图2)，SW480/DDP的细胞存活率较SW480显著增加(P<0.05；图2)。

图2 Lnc-CRCMSL在结直肠癌耐药细胞系中的表达及其细胞生存率情况

2.3 Lnc-CRCMSL过表达对SW480/DDP凋亡率与增殖活力的影响

Lnc-CRCMSL过表达显著提高SW480/DDP的凋亡率，同时也明显降低细胞增殖活力(P<0.05；图3)。

图3 Lnc-CRCMSL过表达对结直肠癌细胞凋亡率与增殖活力的影响

2.4 Lnc-CRCMSL过表达对SW480/DDP迁移与侵袭能力的影响

Lnc-CRCMSL过表达显著抑制了SW480/DDP的迁移和侵袭能力(P<0.05；图4)。

图4 Lnc-CRCMSL过表达对结直肠癌细胞转移的影响

2.5 Lnc-CRCMSL过表达对SW480/DDP的MMP2和MMP9蛋白表达的影响

Lnc-CRCMSL过表达显著降低了SW480/DDP的MMP2和MMP9蛋白表达水平(P<0.05；图5)。

图5 Lnc-CRCMSL过表达对结直肠癌细胞

3 讨 论

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，具有较高的发病率和死亡率。化疗是治疗结直肠癌晚期患者最主要的方式，其中顺铂在结直肠癌患者的治疗中应用较为广泛[5]。据报道，顺铂耐药性是治疗多种癌症的重要问题[6]。Zhuang等[7]发现，miR-143能够调控人胃癌细胞株顺铂的耐药性。Tian等[8]证实miR-490-3p通过下调ABCC2的表达增强了卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。lncRNAs参与细胞生长调控的全部过程，并且在各种癌症中存在异常表达，并与肿瘤的增殖、凋亡、转移和耐药密切相关[9-10]。Yang等[11]研究指出，lncRNA AK126698可通过Wnt途径调控肺癌A549细胞对顺铂的耐药性。lncRNA TUG1在结直肠癌细胞中通过介导miR186/CPEB2表达，影响癌细胞对甲氨蝶呤耐药性[12]。lncRNA MALAT1通过调控EZH2表达水平参与结直肠癌细胞对奥沙利铂的耐药性[13]。

本研究结果显示，Lnc-CRCMSL在结直肠癌细胞系和组织中表达水平均显著下降，并随着病情的加重下降更加明显。此外，通过构建顺铂耐药SW480/DDP细胞系，检测Lnc-CRCMSL在SW480和SW480/DDP中表达情况，发现SW480/DDP细胞系中Lnc-CRCMSL表达水平明显降低，而SW480/DDP细胞的存活率较SW480显著增加。Lnc-CRCMSL在SW480/DDP细胞中过表达后SW480/DDP细胞的存活率显著降低。可见，Lnc-CRCMSL在耐药细胞中过表达可以有效降低顺铂耐药性。

研究表明，化疗药物主要通过诱导肿瘤细胞的凋亡，进而发挥其抗肿瘤的作用[14-16]。化疗药物耐药性的产生与细胞凋亡抑制密切相关。本研究发现Lnc-CRCMSL过表达显著促进结直肠癌细胞的凋亡，降低细胞增殖活力，显著抑制结直肠癌细胞迁移和侵袭。同时，在Lnc-CRCMSL过表达的SW480/DDP中，MMP2和MMP9蛋白表达水平则显著降低。基质金属蛋白酶是锌和钙依赖性蛋白酶，起着降解细胞外基质的作用，而细胞外基质可抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。MMP2和MMP9与多种癌症的发生有关，并在癌细胞的增殖，迁移和侵袭中表现出高水平的表达[17-19]。可见，Lnc-CRCMSL可调控结直肠癌细胞的增殖和迁移，促进细胞凋亡。

综上所述，本研究揭示了Lnc-CRCMSL在结直肠癌细胞耐药中的作用，可能为结直肠癌的治疗提供新的思路和方向。