肠道菌群代谢物TMAO对糖尿病冠状动脉钙化的预测价值

景乐乐， 王中群， 胡惠林

(1.嘉兴市第一医院心内科，浙江省嘉兴市 314000；2.江苏大学附属医院心内科，江苏省镇江市 212000)

糖尿病引起一系列代谢紊乱，导致血管病变、神经病变、糖尿病足等各种并发症[1]。其中，冠状动脉钙化是糖尿病晚期重要的并发症之一，与急性冠状动脉综合征[2]、慢性心衰[3]等心血管事件密切相关。肠道菌群是一种复杂的微生态系统，是维持机体正常运作的必要条件。氧化三甲胺(Trimethylamine-N-Oxide，TMAO)是肠道菌群代谢物之一。研究表明，较高的血浆TMAO水平与2型糖尿病发病率增加有关[4]。最近的研究证实，TMAO通过激活NLRP3炎性小体和核转录因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号促进慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)大鼠血管钙化[5]。本文探讨TMAO对糖尿病冠状动脉钙化的预测价值，为糖尿病心血管并发症的靶向防治提供新思路。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选取2020年6月—2021年6月在嘉兴市第一医院行冠状动脉计算机体层摄影血管造影(computed tomography angiography，CTA)的2型糖尿病患者共45例。根据Agatston钙化积分评分将其分为无钙化组(钙化积分<10分)12例，轻度钙化组(钙化积分10～40分)11例，中度钙化组(钙化积分40～400分)10例，重度钙化组(钙化积分≥400分)12例。所有患者签署知情同意书，方案经本院伦理委员会批准。

1.2 病例选择标准

纳入标准：①年龄35～85岁；②根据WHO(1999年)糖尿病诊断标准确诊为2型糖尿病；③同意行冠状动脉CTA检查；④同意参加本研究且能独立签署知情同意书。排除标准：①严重肝、肾功能不全；②有胃切除术史或肠切除术史；③既往有恶性肿瘤病史；④无法进食者；⑤临床资料不完整；⑥各种原因导致无法独立表达意愿的患者；⑦1个月内服用过或正在服用抗生素者。

1.3 冠状动脉CTA检查

患者排除禁忌证后，选择右侧肘静脉留置针，采取仰卧位，前臂举头上，体轴中心线左偏，使心脏位于扫描区中心，注射造影剂后完成扫描，并进行图像后处理(图像质量控制和三维重建)。

1.4 临床资料的收集及指标检测

收集患者年龄、性别、吸烟史、饮酒史、高血压病史、糖尿病病程、体质指数(body mass index，BMI)等临床资料。所有患者空腹8 h后，采取卧位左臂正中静脉采血5 mL，置于EDTA紫管。4 ℃ 3 000 r/min下离心10 min，移液枪吸取上清液至EP管，检测空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)、糖化血红蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、血清肌酐(serum creatinine，Scr)等指标的水平。采用稳定同位素稀释液相色谱质谱联用技术测定血浆TMAO浓度。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 一般资料

各组男女性别比例、平均年龄、吸烟史、饮酒史、高血压病史、FPG(降糖治疗后)、BMI、HbA1c、TC、ALT、Scr指标比较，差异无显著性(P>0.05)，而各组糖尿病病程、LDL水平比较，差异有显著性(P<0.05)，提示冠状动脉钙化程度随着糖尿病病程增加、LDL水平的升高而加重(表1)。

表1 各组患者的一般资料比较

2.2 各组患者冠状动脉CTA结果及钙化积分

每组患者随机抽取一位，其冠状动脉CTA的重建结果如图1。Agatston钙化积分结果显示各组患者的冠状动脉中，左主干的钙化积分无明显差异，而前降支、回旋支、右冠的钙化积分以及总钙化积分差异具有显著性(表2)。

表2 各组患者冠状动脉钙化积分的比较 单位：分

图1 各组患者冠状动脉CTA重建图

2.3 各组糖尿病患者血清TMAO浓度比较

重度钙化组患者的血清TMAO浓度分别是无钙化组、轻度钙化组、中度钙化组的4.8、1.5、0.9倍(图2)。

图2 各组患者血清TMAO浓度比较

2.4 糖尿病患者血清TMAO与冠状动脉钙化积分的相关性

Pearson相关分析结果显示，血清TMAO水平与冠状动脉总钙化积分呈正相关(r=0.56，P<0.05；图3)。

图3 血清TMAO浓度与冠状动脉总钙化积分的相关性分析

2.5 冠状动脉钙化危险因素的多元线性回归分析

以冠状动脉钙化积分为因变量，糖尿病病程、LDL、TMAO为自变量进行多元线性回归分析，结果提示本研究中的观测值具有相互独立性。根据容差和方差膨胀因子(variance inflation factor,VIF)值可以认为3个自变量间不存在共线性。标准化系数结果显示，TMAO对冠状动脉钙化的影响高于经典的危险因素LDL，但是低于糖尿病病程(表3)。

表3 冠状动脉钙化危险因素的多元线性回归分析

2.6 血清TMAO对糖尿病冠状动脉钙化的预测价值

ROC曲线下面积为0.80(95% CI：0.698～0.905，P<0.05)。TMAO浓度为12.67 μmol/L时预测糖尿病患者冠状动脉钙化的敏感性为73%，特异性为97%，约登指数最大为0.70(图4)。

图4 ROC曲线评估糖尿病患者血清TMAO浓度对冠状动脉钙化的预测价值

3 讨 论

糖尿病斑块内钙化是糖尿病患者重要的大血管并发症，其重要驱动因素包括氧化应激、内皮功能障碍、矿物质代谢改变以及炎症细胞及炎症因子的产生增加[6]。晚期糖基化终末产物AGEs及其受体通过多种机制促进钙化[7]，内皮细胞和平滑肌细胞产生的肿瘤坏死因子-α会诱导骨形态发生BMP-2的产生，进而促进成骨[8]，高血糖本身能够通过增加柠檬酸循环中的葡萄糖氧化来增加氧化应激，上调Runx2基因表达进而促进血管钙化[9-11]。

研究表明，正常的肠道菌群可以维持机体的代谢活动和免疫反应，而菌群类型或比例的改变可能导致人体相关疾病易感性的改变，糖尿病患者存在肠道菌群失调[12-13]。TMAO是肠道菌群的一种代谢物，它是由TMA在肝脏黄素单氧化酶的作用下氧化生成。TMAO能够加重高脂喂养小鼠的糖耐量异常,高浓度TMAO能够促进高血糖和代谢功能障碍[14]。TMAO通过影响胰岛素抵抗、宿主肥胖以及激素分泌，进而促进糖尿病的发生发展[15]。NF-κB信号是经典的钙化相关信号通路，TMAO通过激活NLRP3炎性小体和NF-κB信号促进CKD大鼠主动脉钙化[5]。

本文结果显示，与无钙化组比较，其他3组患者血清TMAO浓度明显升高，但中度钙化组与重度钙化组患者血清TMAO浓度差异无显著性，这可能与本研究样本量较少有关。而Pearson相关性分析结果显示，血清TMAO浓度与冠状动脉钙化总积分呈正相关(r=0.56，P<0.05)。结果提示了TMAO在糖尿病患者冠状动脉钙化进展中的正向作用。受试者工作曲线显示曲线下面积为0.80，提示血清TMAO浓度一定程度上可以预测糖尿病患者冠状动脉钙化的严重程度。

本研究结果显示血清TMAO浓度与糖尿病患者冠状动脉钙化程度的相关性，并揭示了TMAO对糖尿病冠状动脉钙化的预测能力。但本研究仍存在一定局限性。①样本量偏少，统计可能存在一定偏倚，未对TMAO和各冠状动脉分支的钙化程度进行相关性分析。②本研究仅为观察性研究，TMAO影响糖尿病冠状动脉钙化的具体机制如何，本研究并未涉及。现有研究表明TMAO衍生的全身炎症介导成骨内皮祖细胞影响血管钙化[16]，也有研究表明TMAO通过氧化应激和细胞凋亡途径促进CKD患者血管钙化[17]，推测TMAO可能通过影响包括氧化应激、炎症等不止一种驱动因素介导糖尿病冠状动脉钙化。

综上，TMAO与糖尿病患者冠状动脉钙化密切相关，有望成为糖尿病冠状动脉钙化防治的新靶点。