耐盐促生芽孢杆菌的筛选及其对盐胁迫下燕麦生长的影响

李丽艳，谭海霞，李 婧，王连龙，杜迎辉，徐志文

(1.领先生物农业股份有限公司，河北 秦皇岛 066000； 2.河北省农业生物技术技术创新中心，河北 秦皇岛 066000； 3.河北环境工程学院 生态学系，河北 秦皇岛 066000)

盐碱地是重要的后备土地资源，为确保粮食安全，挖掘盐碱地的生产潜力成为农业开发的重要研究内容。按照生态选择种植适合的耐盐碱植物，是实现盐碱地利用的有效途径之一。燕麦(L.)为禾本科燕麦草属植物，是粮饲兼用作物，生态适应性广，具有耐盐碱的特点，是可用于盐碱地改良利用的作物之一。

盐胁迫是制约作物生长的主要因素之一。武俊英等认为，高盐(含盐量2%)胁迫下，燕麦幼苗生长会受到严重抑制。赖弟利等探究了盐胁迫对燕麦幼苗生长及其生理生化性状的影响，认为低盐环境对燕麦生长有促进作用，但当盐浓度高于0.2%时，燕麦生长即受到明显的胁迫。

植物根际促生菌可通过分泌生长素(IAA)、固氮溶磷、产铁载体等途径改善土壤环境，有效促进植物生长。王丹等从新疆盐碱土中筛选出耐盐菌株，发现该菌株可缓解小麦盐胁迫，并能促进幼苗生长。王艳宇等筛选得到一株耐盐碱菌DQSA1，可提高植物的耐盐碱能力。目前，盐胁迫下促生菌的筛选已成为国内外研究的热点之一。

芽孢杆菌具有营养简单、抗逆性强等特性，是土壤生态系统中的优势菌种。本研究拟采取定向筛选法，从不同盐生植物根际土中筛选具有促生效应的耐盐芽孢杆菌菌株，并利用盆栽试验研究盐胁迫下分离到的促生芽孢杆菌对燕麦生长的影响，以期为耐盐促生菌剂和菌肥的开发提供菌种资源，为耐盐促生菌在盐碱地生产中的应用等提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试盐生植物采自秦皇岛北戴河湿地(119°30′51″～119°31′2″E，39°50′28″～39°50′46″N)，包括盐地碱蓬()、盐角草()、芦苇()、水麦冬()。采样区属于典型的滨海湿地，属温带大陆季风型气候，土壤类型为滨海盐碱土。将供试盐生植物生长土壤的基本理化性状整理于表1，总的来看，其碱解氮、有效磷含量适中，但有机质含量不足，pH值和水溶性盐含量偏高，属滨海中度盐碱土。

表1 供试植物生长土壤的基本理化性状

试验用分离培养基为pH值9.0，含有不同质量分数(分别为5%、10%和15%)NaCl的LB固体培养基。

供试作物为北京正道生态科技有限公司提供的燕麦耐盐品种燕王。

1.2 试验方法

1.2.1 耐盐菌株的分离

于研究区采集长势健壮的盐地碱蓬、盐角草、芦苇、水麦冬植株，装入无菌袋中，带回实验室，于24 h内完成根际芽孢杆菌的分离。植物根际土样品制备参考黄智华等、白文娟等的方法，并做适当调整。将10 g根际土样品放入无菌三角瓶中，加入90 mL无菌生理盐水，振荡60 min，然后80 ℃恒温水浴30 min，接着按10倍梯度依次稀释后涂布于含有不同质量分数NaCl的LB固体培养基上，30 ℃恒温培养2～3 d。根据菌落形态、颜色、大小，挑取单菌落划线培养于含有等同质量分数NaCl的LB固体培养基上，经反复多次纯化，保存于25%(体积分数)甘油管中，-80 ℃冻存。

1.2.2 分离株高盐条件下促生能力检测

为了检测分离株在高盐条件下是否具备明显的促进植物生长的潜力，根据文献[9-12]的方法并做适当调整，对其在5%(质量分数)NaCl条件下溶解有机磷、无机磷，产IAA，解钾，固氮的能力进行测定。参照文献[13-15]的方法并做适当调整，以含有5%(质量分数)NaCl的LB培养基作为发酵培养基，利用Salkowski比色法测定分离株在含有5%(质量分数)NaCl的LB培养基上IAA的产生量。

1.2.3 分离株的生态适应性

参照文献[17]的方法并做适当调整，将筛选出的在高盐条件下具有促生能力的分离株接种至生态适应性检测培养基中，测定其耐酸碱和耐盐的性能，30 ℃恒温培养3 d，观察菌株生长状况。

1.2.4 盐碱土条件下分离株对燕麦的促生性能

以曹妃甸湿地盐碱土(有机质13.5 g·kg，有效磷71.7 mg·kg，速效钾478 mg·kg，碱解氮44 mg·kg，水溶性盐16.3 g·kg，pH值8.37)为基质，与领先现代农业科技示范园区闲置5 a的常规土(有机质18.1 g·kg，有效磷97.2 mg·kg，速效钾112 mg·kg，碱解氮100 mg·kg，水溶性盐0.2 g·kg，pH值7.2)进行混配，调节配比使水溶性盐含量为5 g·kg，用于盆栽试验，每盆装土1 kg。选取大小均匀一致的燕麦种子，每盆栽种10粒。每个处理3个重复。待燕麦出苗后，浇灌筛选得到的分离株的发酵液，使盆栽土中所施菌数达到10CFU·g，10 d后第二次浇灌，整个生长期等量浇灌2次，对照浇灌等量无菌培养液(CK)。生长60 d后，测量不同处理下燕麦的株高、地上部鲜重、茎粗等生长指标，并采用WinRHIZO PRO 2013型植物根系分析系统(加拿大Regent)对根系指标进行分析。生理指标——叶绿素含量、丙二醛(MDA)含量、脯氨酸含量，以及过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性的测定参照文献[18-19]的方法进行。

1.2.5 基于16S rDNA的分离株菌种初步鉴定

参照文献[20-21]的方法对分离株进行菌种鉴定。按常规细菌DNA提取方法制备样品总DNA，采用细菌通用引物27F和1492R对分离株的16S rDNA基因进行PCR扩增，扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后送至北京新时代众合科技有限公司测序。测序结果用EzBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/)进行在线分析，采用Mega 6.0软件进行比对，基于邻接法(NJ)构建系统发育树，采用自举法(Bootstrap)评估分支可信度，Bootstrap取样值大于1 000。

1.3 数据分析

采用Excel 2010软件整理数据。采用DPS v12.01软件对数据进行方差分析，对有显著(<0.05)差异的，采用LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 耐盐芽孢杆菌的分离筛选

本研究从4种盐生植物根际土中分离获得13株耐盐芽孢杆菌(表2)，其中，分离自盐地碱蓬的有6株，分离自盐角草的有2株，分离自芦苇的有3株，分离自水麦冬的有2株。

表2 分离得到的耐盐芽孢杆菌的基本信息

选择耐盐培养基上菌落长势旺盛、单菌落数量最多的3株优势菌(YP2、YP4、SM12)进行菌落形态分析：YP2菌落在NA平板上呈圆形，较湿润，直径2～3 mm，近乳白色，不透明；YP4芽孢近似椭圆形，中生或次端生，在NA平板上菌落呈圆形，较湿润，近米黄色，不透明；SM12菌落在NA平板上呈圆形，扁平，湿润，有黏性，具褶皱，偏乳白色。另外，经测定，这3株菌均为革兰氏阳性芽孢杆菌。

2.2 分离株在高盐条件下的促生能力

分离得到的13株菌均具有产IAA的活性(表3)，其中，以YP2、YP4的活性最强，其在5%(质量分数)NaCl条件下的IAA产量分别达到62.1、50.0 mg·L。YP2能在以有机磷或无机磷为唯一磷源的培养基上产生较大的透明水解圈，说明其具有较强的溶解有机磷和无机磷的能力。另外，YP2可在钾长石和阿须贝无氮培养基上很好地生长，说明其具有一定的解钾和固氮的能力。YP4具有较强的溶解无机磷的能力，且具有一定的解钾和固氮的能力，但不能溶解有机磷。SM12具有溶解有机磷和解钾、固氮的能力。综上，我们推测YP2、YP4和SM12具有较大的促进植物生长的潜力，可作为供试菌株用于促生试验。

表3 分离株的促生指标

2.3 分离株的生态适应性

YP2、YP4和SM12均可在pH值6.0～9.0的培养基中正常生长(表4)，其中，YP2可以在pH值5.0～10.0的培养基中生长良好，而YP4和SM12在pH值10.0的培养中无法生长，说明YP2具有更强的耐碱能力。

表4 分离株的生态适应性

耐盐能力测定结果表明，YP2、YP4和SM12均可耐受10%(质量分数)的NaCl，其中，YP2对盐的耐受性最强，最高可耐受15%(质量分数)的NaCl，说明该菌株的耐盐能力非常强。

2.4 盐胁迫下接种分离株对燕麦生长的影响

在盐胁迫下接种3株分离株均能显著(<0.05)提高燕麦株高和地上部鲜重(表5)，与对照组(CK)相比，接种YP2、YP4和SM12的燕麦株高分别增加72.02%、48.26%、68.39%，地上部鲜重分别增加186.11%、79.86%、138.89%。接种YP2、SM12的燕麦茎粗较CK分别显著(<0.05)增加42.58%和28.23%。

表5 盐胁迫下接种促生菌对燕麦生长的影响

与CK相比，接种YP2、YP4、SM12促进了燕麦根系的发育(图1)，燕麦总根长、根系总表面积、根尖数等均显著(<0.05)增加，总根长分别增加了392.35%、198.46%、262.65%，根系总表面积分别增加了378.07%、179.71%、218.50%，根尖数分别增加了518.85%、298.95%、312.65%。

A，CK；B，接种YP2；C，接种YP4；D，接种SM12。

总的来看，在盐胁迫条件下接种YP2、YP4、SM12能促进燕麦的生长发育。

将燕麦的株高、茎粗、地上部鲜重、总根长、根系总表面积、根尖数、根系直径作为自变量，运用主成分分析法综合评价供试菌株的促生效果。主成分分析共提取到2个主成分，累积贡献率为98.676%，其中，第一主成分在株高、茎粗、地上部鲜重、总根长、根系总表面积、根尖数上占有较大的载荷。根据综合得分(表6)判断，盐胁迫下接种分离株对燕麦生长有促进作用，其中，YP2的效果最好。

表6 分离株对燕麦的促生效果排名

接种YP2、YP4和SM12后，燕麦叶片的叶绿素、脯氨酸含量均显著(<0.05)高于CK(表7)，其中，接种YP2的叶绿素、脯氨酸含量均最高，分别比CK增加312.20%、124.10%，说明接种分离株有助于提高盐胁迫下燕麦叶片的光合活性，增强燕麦的抗盐能力。

表7 盐胁迫下接种分离株对燕麦生理特性的影响

接种YP2、YP4和SM12后，燕麦叶片的MDA含量均较CK显著(<0.05)降低，且接种不同分离株的燕麦叶片MDA含量差异显著(<0.05)，说明接种分离株可降低盐胁迫对燕麦叶片膜系统的伤害程度。各处理中，接种YP2的燕麦叶片MDA含量最低，较CK降低43.34%。

接种YP2、YP4、SM12后，燕麦叶片的POD、CAT活性均显著(<0.05)高于CK，其中，接种YP2的燕麦POD、CAT活性均最高，分别较CK升高274.09%和198.60%，说明在盐胁迫下接种分离株可通过提高抗氧化酶的活性来增强植物对盐胁迫的抗性。

2.5 分离株的菌种鉴定

以YP2的基因组为模板，27F、1492R为引物，扩增到约1.4 kb的条带。将其测序结果提交至GenBank数据库(ID: MW 931715)，与EzBioCloud数据库中的模式菌株进行比对，根据比对结果，下载与其同源性最高(一致性值在98%～100%)的菌株的序列，采用邻接法构建系统发育树(图2)。结果显示，该菌与弯曲芽孢杆菌()的亲缘关系最近，认为YP2可能为弯曲芽孢杆菌。

图2 基于16S rDNA的YP2菌株的系统进化树

3 讨论

盐胁迫是导致植物生长受限的主要因子之一，多数根际促生菌很难适应高盐环境，因此目前开发研制的大部分生物菌剂在改良盐碱土时效果不佳。筛选具有广泛抗逆性的高效菌株、挖掘耐盐促生菌种，是改良修复盐碱地的重要途径之一。芽孢杆菌具有抗逆性强等特点，相比其他微生物更具开发优势。本研究从4种盐生植物——盐地碱蓬、盐角草、芦苇、水麦冬根际土中分离得到13株耐盐碱芽孢杆菌，从中进一步筛选到3株能耐受10%(质量分数)NaCl高盐环境，且有促生作用的菌株YP2、YP4、SM12，其中YP2在含有5%(质量分数)NaCl环境下的IAA产量为62.1 mg·L，高于王丹等、张志东等筛选菌株的IAA产量(15.90、45.32 mg·L)，说明YP2具有较强的促生能力。经形态学、16S rDNA序列分析，初步鉴定YP2菌株为弯曲芽孢杆菌。

研究表明，向盐碱土中接种耐盐促生菌可提高植物的抗盐性，对植物生长具有明显的促生作用。盐胁迫环境下，接种刘佳莉等筛选的菌株A-4后，燕麦的株高、鲜重、根长分别比对照组提高14.95%、 2.38%、24.56%。与其相比，本研究筛选的3株菌(YP2、YP4、SM12)在增加燕麦株高、地上部鲜重、促进根系形态发育上的效果更好，其中，尤以接种YP2的效果最佳。推测分离株通过产生IAA、解磷、解钾等促进作物根系生长，提高根系对营养的吸收，进而促进燕麦地上部的生长，但其具体的促生机理还需进一步深入研究。

盐胁迫下，植物光合作用强度降低，膜质过氧化，活性氧平衡被破坏，生长受阻，细胞生理功能受到破坏。植物促生菌在盐胁迫下会通过诱导植物建立抵抗或忍耐机制，增强植物的抗盐能力。武俊英等认为，盐胁迫下燕麦光合作用受阻，叶片叶绿素含量下降。本研究在盐胁迫下接种分离株后，燕麦叶片的叶绿素含量显著升高，MDA含量显著下降，脯氨酸含量和抗氧化物酶的活性显著上升，这与许多研究的结论一致，说明接种分离株可有效促进叶片光合色素的合成，抑制叶片中活性氧的产生，从而减少氧化损伤，并通过脯氨酸的大量积累降低叶片细胞内的水势，减缓盐胁迫引起的渗透胁迫。总的来看，在盐胁迫条件下，接种分离株可有效缓解盐胁迫对燕麦生长的抑制，提高燕麦的耐盐性。

综上所述，本研究分离出的3株耐盐促生芽孢杆菌，在盐胁迫下均能显著降低燕麦叶片中的MDA含量，提高叶绿素含量、脯氨酸含量，及POD、CAT活性，对燕麦生长具有明显的促生效果，尤其是YP2菌株的促生效果最好，可作为盐碱地专用生物菌剂进行开发。但是，关于这3株分离株对燕麦的促生机制等还有待进一步深入探讨，其在田间的实际应用效果也还需进一步试验验证。