茶籽饼对黄芪和三七根腐病病原菌的抑制效果

杨秀娟，李卫雅，李彩苗，成碧君，高 芬，赵 军

(1.山西医科大学 公共卫生学院，山西 太原 030001； 2.山西大学 应用化学研究所，山西 太原 030006； 3.南京师范大学 地理科学学院，江苏 南京 210023)

黄芪是药用价值很高的中药材，主要分布于我国山西、内蒙古和甘肃一带，其中山西省浑源、应县是黄芪的道地产区。三七是我国特有的名贵中药材，素有“金不换”“南国神草”等美誉。近年来，随着黄芪和三七需求量的持续增加，大力开展人工栽培和集约化种植已成为满足国内外对黄芪和三七需求的重要途径。然而，连年大面积单一种植，导致土传根腐病害严重。山西黄芪根腐病发病率一般为30%，严重时可达60%，内蒙古地区严重时可达80%，而甘肃省发病率达35%～92%。三七因根腐病的常年损失达5%～20%，严重时可达70%以上，甚至绝收。黄芪和三七根腐病已成为影响其产量与品质的严峻问题，是制约其产业发展的重要阻碍。

根腐病致病因素复杂，可由多种病原细菌、真菌、线虫单独或混合致病，其中，土传病原真菌的富集是导致黄芪和三七产生根腐病的主要诱因。黄芪根腐病的优势致病菌主要为锐顶镰刀菌()、腐皮镰刀菌()和尖孢镰刀菌()，三七根腐病主要的致病菌有镰刀孢()、土赤壳菌()、链格孢()、恶疫霉()、双孢柱孢()、假单胞属(sp.)、槭菌刺孢()等。根腐病的防治方法有土壤熏蒸、添加有机物质、生物防治、非寄主作物轮作、植物源农药等，其中，植源性农药防治具备对生态环境和人类健康安全的特点而备受关注。何晓婷等研究了苦楝子、瑞香狼毒等9种植物提取物对三七根腐病病原菌的抑菌强度，发现苦楝子提取物对其具有良好的抑制效果。王亚萍等研究发现，油茶籽饼的甲醇提取物能显著抑制黄曲霉菌生长，且抑制效果随提取物浓度的增大而增强，表明茶籽饼具有抑制真菌病害的潜能，其抑菌成分值得深入探究。茶籽饼是油茶(Abel.)种子炼油后一种副产品，茶皂素是其主要成分，具有一定的抑菌作用和明显的土壤修复作用。黄继光等通过菌丝生长速率抑制试验检测茶皂素对番茄、柑橘、西瓜等植物病原菌的抑菌效果，结果显示，不同浓度的茶皂素对不同植物病原菌的抑制效果存在差异。Wang等研究表明，茶籽饼提取物能够抑制黄曲霉菌丝生长，引起菌丝畸形，减少分生孢子的产生，并抑制黄曲霉毒素的产生。Meng等研究发现，茶树油粕粗提物可以显著抑制炭疽菌和青霉菌的生长，且能够较好地控制香蕉和柑橘的炭疽病和青霉病发生。然而利用茶籽饼防治根腐病的相关研究很少，茶籽饼能否对黄芪、三七根腐病病原菌产生抑制作用，其中哪些物质成分具有抑菌作用，能力如何尚未见报道。因此，为探究茶籽饼水浸提液和挥发性气体对黄芪、三七根腐病优势病原菌生长的影响，并在Yang等利用GC-MS分析所得的茶籽饼中挥发性气体有机化合物具体成分的研究基础上进一步探究各成分的抑菌能力，以黄芪、三七根腐病病原菌的优势菌种作为供试菌，检测茶籽饼水浸提液、挥发性气体、茶皂素和挥发性有机化合物(volatile organic compounds，VOCs)对供试菌的抑制作用，明确茶籽饼抑制根腐病病原菌生长的物质成分与抑菌能力，为针对性地防治根腐病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

黄芪根腐病病原菌锐顶镰刀菌()、腐皮镰刀菌()、尖孢镰刀菌()由山西大学应用化学研究所高芬副教授提供；三七根腐病病原菌腐皮镰刀菌()、尖孢镰刀菌()、土赤壳菌(sp.)由南京师范大学地理科学学院土壤利用与修复实验室提供。其中，黄芪根腐病病原菌、和三七根腐病病原菌、分别从黄芪(山西)和三七(云南)根腐病植株的病根中分离得到，是同一种属不同生理小种(黄芪专化型和三七专化型)的病原菌。

将新鲜黄芪、三七根腐病病原菌用无菌打孔器打取直径8 mm的菌块，分别接种到PDA固体培养基(PDA平板)中央，于28 ℃恒温培养箱中培养7 d左右，备用。

试剂：1-辛烯-3-醇(O815142-50 mL)、2-甲基丁酯(M813946-25 mL)、2-甲基丁酸(M813314-100 mL)，上海麦克林生化科技有限公司；丁酸丁酯(B103464-100 mL)、正丁醇(B111581-100 mL)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；茶皂素(分子量1 200)，甘肃丝陆科技有限公司；茶籽饼，福建油茶加工公司；茶皂素纯品，甘肃丝陆科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 茶籽饼水浸提液对黄芪、三七根腐病病原菌的菌丝生长抑制试验

称量25 g茶籽饼放入装有75 mL无菌蒸馏水的锥形瓶中，浸泡48 h，配置成250 g·L的母液，再分别用灭菌的定量滤纸和0.22 μm无菌滤膜过滤，将过滤后的茶籽饼水浸提液按比例加入培养基中，快速混匀，制成含有2、5、10 g·L茶籽饼水浸提液的PDA培养基，以加入等体积无菌水作为空白对照，分别接种上述黄芪、三七根腐病病原菌共6株，每株菌设置5 个平行样，密封培养皿口，28 ℃连续培养8 d，逐日测量菌落直径，并计算抑菌率。

1.2.2 茶皂素对黄芪、三七根腐病病原菌的菌丝生长抑制试验

称取25 g茶皂素纯品置于100 mL无菌水中，溶解，配置成250 g·L的母液，依次用无菌定量滤纸、0.22 μm一次性滤膜过滤后，将茶皂素滤液定量加入PDA培养基中，使其终浓度分别为0.5、1.0、2.0 g·L，制备PDA平板，静置凝固。在PDA平板中心分别接种6株根腐病菌的新鲜菌块，每株菌设置5个平行样，以接菌PDA块为对照(CK)，密封平板后放入28 ℃恒温培养箱连续培养7 d，逐日测量菌落直径，观察不同浓度茶皂素对菌丝生长的影响，并计算抑菌率。

1.2.3 茶籽饼挥发性气体对黄芪、三七根腐病病原菌的菌丝生长抑制试验

将PDA培养基均匀铺板，静置凝固，然后接种6株根腐病病原菌，培养好后使用无菌打孔器制备圆形菌块，并接种在新的PDA平板中心，每株菌设置5个平行样，同时以接种PDA块作为对照(CK)。参照文献[18]的方法，分别称取0.1、0.5 g茶籽饼放入培养皿盖中，加入0.9 mL的无菌水使其终浓度为10、50 g·L，密封皿口，28 ℃连续倒置培养6 d，逐日测量菌落直径，并计算抑菌率。

1.2.4 挥发性有机化合物对黄芪、三七根腐病病原菌的菌丝生长抑制试验

Yang等通过GC-MS检测茶籽饼的挥发性气体，共检测出18种主要的挥发性化合物，利用其中5种有机化合物1-辛烯-3-醇、2-甲基丁酯、2-甲基丁酸、丁酸丁酯和正丁醇，进行菌丝生长抑制试验。将PDA培养基均匀铺板，静置凝固，使用无菌打孔器将培养好的6株根腐病病原菌制备成圆形菌块，接种在新铺板的PDA平板中心，每株菌设置5个平行样，同时以接菌PDA平板作为对照(CK)。倒置已接菌平板，在培养皿盖上放置一块1/8无菌滤纸，用移液枪分别吸取10、50、100 μL挥发性化合物加到无菌滤纸上，迅速盖好平板，密封后放入28 ℃恒温培养箱连续培养7 d，逐日测量菌落直径，观察不同浓度的挥发性化合物对菌丝生长的影响，并计算抑菌率。

抑菌率(%)=

(1)

式(1)中，试验组包括不同浓度的茶籽饼水浸提液、茶皂素、茶籽饼挥发性气体和5种挥发性有机化合物。

1.3 数据处理

试验所得数据均采用Excel 2010软件进行分析，并用SPSS 22.0软件进行数据分析，对有显著(<0.05)差异的应用Duncan氏新复极差法对不同处理组进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 茶籽饼水浸提液对黄芪、三七根腐病病原菌的抑菌作用

茶籽饼无菌水浸提液对黄芪根腐病病原菌抑制作用结果显示，培养至第4天，终浓度为2 g·L茶籽饼浸提液处理对生长抑制效果最佳，抑制率高达52.08%；而在5 g·L处理下抑制效果显著优于2 g·L，在5 g·L处理下抑制效果显著优于10 g·L。在茶籽饼无菌水浸提液对三七根腐病病原菌的抑制试验中，培养至第4天，终浓度为5 g·L茶籽饼浸提液处理对抑制效果好，抑制率达25.31%；终浓度为5 g·L茶籽饼浸提液处理对和的抑制效果优于对sp.的抑制效果，终浓度为10 g·L茶籽饼浸提液处理在培养至第4天对的抑制效果最佳，抑制率高达35.60%(表1)。

表1 培养至第4天茶籽饼水浸提液对根腐病病原菌的抑制率

2.2 茶皂素对黄芪、三七根腐病病原菌的抑菌作用

在试验浓度范围内，茶皂素对黄芪、三七根腐病病原菌的抑制作用均随浓度的增加而增强(除外)，即2.0 g·L茶皂素对供试菌的抑制效果最好，且对黄芪根腐病病原菌的抑制效果显著优于三七根腐病病原菌。培养至第4天，2.0 g·L茶皂素对黄芪根腐病病原菌、、的抑菌率分别为41.46%、28.40%、42.72%；对三七根腐病病原菌、、sp.的最大抑菌率分别为13.04%、21.84%、21.57%(图1)。

A、B、C分别为黄芪根腐病病原菌腐皮镰刀菌(F.solani)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、锐顶镰刀菌(F.acuminatum)的抑制率。D、E、F分别为三七根腐病病原菌腐皮镰刀菌(F.solani)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、土赤壳菌(Ilyonectria sp.)的抑制率。

2.3 茶籽饼挥发性气体对黄芪、三七根腐病病原菌的抑菌作用

在茶籽饼挥发性气体对黄芪、三七根腐病病原真菌的抑制作用试验中发现，相对抑制率与挥发性气体浓度呈正比。当处理组浓度为50 g·L，培养至第6天时，对黄芪、三七根腐病病原菌的抑制率达到最高，对黄芪根腐病病原菌、、的抑制率分别为35.73%、51.01%、52.36%；对三七根腐病病原菌、和的抑制率分别为52.16%、60.16%、40.47%，且茶籽饼挥发性气体浓度为10 g·L、50 g·L处理对、的抑制效果均优于sp.(表2)。

表2 培养6 d茶籽饼中挥发性气体对黄芪、三七根腐病病原菌的抑制率

2.4 茶籽饼中挥发性有机化合物对黄芪、三七根腐病病原菌的抑制作用

2.4.1 对黄芪根腐病病原菌的抑制作用

5种挥发性有机化合物对黄芪根腐病病原菌、、抑制作用基本相同，抑制率随药品加入量的增加而上升，但相对抑制率存在差异。1-辛烯-3-醇对黄芪根腐病病原菌的抑制能力最强，加入50 μL培养至第6天，对、、的抑制率分别为87.30%、89.19%、90.70%(表3和图2)。2-甲基丁酯和丁酸丁酯对黄芪根腐病病原菌的抑制作用均随着培养时间的延长而逐渐下降，在刚加入药品时，抑制效果最好。加入100 μL培养2 d，丁酸丁酯对的抑制率高达78.38%。正丁醇对不同菌株表现出不同的抑制作用，随着培养时间的延长对的抑制效果变化不大，而对、的抑制率则随着培养时间的延长而下降。

2.4.2 对三七根腐病病原菌的抑制作用

1-辛烯-3-醇对三七根腐病病原菌的抑制作用非常明显，随着加入量的增加抑制率逐渐上升，当加入量达50 μL以上培养6 d，可观察到菌丝已枯死，相对抑制率高达88.24%。当加入量达50 μL以上培养至6 d，1-辛烯-3-醇对三七根腐病病原菌的抑制效果比较理想，抑制率为88.24%。2-甲基丁酯对三七根腐病病原菌的抑制作用随着培养时间的延长而逐渐减弱。2-甲基丁酯的抑制作用比较复杂，对于和sp.，当加入量为100 μL、培养时间为4 d时，抑制率达到最大值，分别为38.10%和52.08%。丁酸丁酯对三七根腐病病原菌和的抑制效果较差，相对抑制率多数低于50%。1-辛烯-3-醇、2-甲基丁酸和丁酸丁酯对三七根腐病病原菌sp.的抑制作用均非常显著，当加入量达50 μL以上时，可观察到菌丝已枯死，相对抑制率为80.00%。正丁醇对三七根腐病病原菌sp.的抑制作用也比较明显，抑制率随药品加入量的增加和培养时间的延长而上升(表3、图2)。

表3 五种挥发性有机化合物对黄芪、三七根腐病病原菌的抑制率

A、B、C分别为三七根腐病病原菌土赤壳菌和黄芪根腐病病原菌腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌培养6 d的菌落形态。1、2、3、4、5分别为药品1-辛烯-3-醇、2-甲基丁酯、2-甲基丁酸、丁酸丁酯、正丁醇。

3 讨论

本研究结果显示，茶籽饼无菌水浸提液及其挥发性气体对黄芪、三七根腐病病原真菌有不同程度的抑制作用，茶籽饼无菌水浸提液对黄芪的抑制效果最佳。茶皂素对病原菌的抑制效果也与病原菌的种类有关。茶籽饼中茶皂素对黄芪、三七根腐病病原菌有抑制作用，且对黄芪根腐病病原菌的抑制效果显著优于三七根腐病病原菌。整体来说，随着茶皂素浓度的增加，对黄芪、三七根腐病病原菌的抑制率也随之提高，茶皂素浓度为2.0 g·L时相对抑制率最好。黄继光等发现，1 g·L茶皂素的抑菌效果最好，特别是对稻瘟病菌()和柑橘青霉病菌()的抑制效果较好。孟祥春等在茶皂素对果蔬采后致病菌的研究中发现，随着茶皂素浓度的升高，所检菌落直径逐渐减小，菌丝生长抑制率逐渐提高。

茶籽饼挥发性气体对黄芪、三七根腐病病原菌的抑制作用随浓度的增加而增强。多项研究表明，植物源挥发性物质具有较强的抑菌活性，王媛媛和段一帆研究发现，竹叶的挥发性化合物对植物病原菌有较好的抑制作用；赵亚红等研究表明，杨梅、青梅和茶的挥发性有机化合物对空气微生物的生长有抑制作用，其中，茶的挥发性有机化合物对真菌日平均抑制率达34.6%；卫强等研究结果显示，棕榈花、叶、茎的挥发性化合物对特定病原菌有特殊抑菌效果。在茶籽饼的5种挥发性有机化合物中，1-辛烯-3-醇、2-甲基丁酸具有良好的抑菌作用，是茶籽饼抑菌作用的有效成分，其处理的供试病原菌(三七根腐病病原菌除外)菌丝均处于枯死状态，这为茶籽饼防治中草药根腐病提供了思路。翟永彪研究表明，1-辛烯-3-醇对灰霉病菌有显著的杀菌和抑菌活性。挥发性有机化合物2-甲基丁酯、丁酸丁酯和正丁醇的抑菌作用存在菌株差异，对黄芪根腐病病原菌来说，2-甲基丁酯和丁酸丁酯在培养初期抑菌作用最强，随后抑菌效果逐渐变差。刘元元等筛选的棉花黄萎病生防菌N4拮抗菌中存在挥发性物质2-甲基丁酸，其对棉花黄萎病致病菌具有较强的抑菌作用，其抑菌作用可能是通过pH值影响或2-甲基丁酸作为小分子信号调节黄萎病致病菌的生长。目前，其他几种挥发性物质的抑菌作用尚未见报道，其详细的抑菌机制仍需进一步研究。

虽然国内外学者在植物根腐病防治研究中已取得了重大研究进展，但实际生产中，因黄芪和三七根腐病发生情况比较复杂，存在复合侵染，且田间病害的发生环境难以控制，种植地区地形地貌复杂，为很多防治措施的实施造成了很大困难。因此，针对黄芪和三七根腐病，应该采取综合防治措施，选择更易实施的手段进行防治，茶籽饼能够抑制多种病原菌的生长，且可随植物移栽时一并添加到植物根部附近土壤中，缓慢释放，更有利于减轻病害发生。茶籽饼对中药材根腐病害的防治有很大的应用潜力，后续有必要针对茶籽饼对黄芪和三七根腐病田间防治效果进行深入研究。

4 结论

茶籽饼水浸提液、茶皂素、挥发性气体及其5种组分均对黄芪、三七根腐病病原真菌具有抑制作用，其中茶籽饼水浸提液对黄芪的抑制效果最好，1-辛烯-3-醇和2-甲基丁酸的抑菌能力最强。