绿豆芽菜制作工艺优化及营养功能成分分析

2022-06-28王可心杨思敏林瑞嫦刘蓓蓓高玉萌李鑫高小丽

食品研究与开发 2022年12期

王可心，杨思敏，林瑞嫦，刘蓓蓓，高玉萌，李鑫，高小丽

（西北农林科技大学农学院，陕西咸阳 712100）

发芽无需复杂的设备、生产周期快、在生产中占用的空间很小，因此是一种简单且成本低廉的加工过程[1-2]，同时芽菜的产量较高[3]而受到人们的喜爱。绿豆芽菜因其营养价值大于绿豆籽粒，口感脆嫩，在中国芽菜消费中占比最大。Mbithi等[4]和Gan等[5]研究表明，发芽后绿豆籽粒中的营养物质含量和药用价值得到提高，一方面绿豆籽粒萌发后原本存在于其体内的胰蛋白酶被激活由结合态转化为游离态，单宁含量下降，植酸等抗营养因子减少，另一方面绿豆籽粒发芽后碳水化合物、蛋白质、脂肪酸等主要常量营养成分分解代谢为单糖、游离氨基酸和有机酸，更易于被人体吸收，营养价值大大提高[6]。此外，萌发过程中维生素 A、维生素 B17、维生素 C 及 γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）含量增加，常吃绿豆芽菜能有效预防心血管疾病、直肠癌和与年龄相关的功能衰退等慢性疾病的发生[7-9]。

近年来，中国芽菜产业发展迅速，芽菜的家庭小作坊式生产逐渐转变为工业化大规模生产。生物和非生物诱导因子进行调节可以强化发芽过程中营养成分及其他生物活性物质的改变，但是随着食品安全越来越受到重视，人们对芽苗菜的品质提出了更高的要求，低加工和无添加剂成为芽苗菜研究热点[10-11]。

工业化豆芽培育一般包括烫种、浸种、控温和喷淋等程序，不同的工序对豆芽的产量及品质有不同程度的影响，从而关系到豆芽生产的经济效益[12-14]。目前，系统研究非生物因素的改变对豆芽产量及品质的影响较少。浸泡时间、发芽温度及淋喷间隔作为绿豆芽菜制作工艺中必不可少的考虑因素，优化出最佳发芽条件对绿豆芽菜的生产具有重要意义。目前，我国绿豆种皮的颜色主要包括绿色和黑色，但却没有对不同颜色绿豆发芽条件的研究。因此，本研究以豆芽产量最大化为目的，通过单因素试验结合响应面分析，以芽豆比为响应值，对不同品种绿豆浸泡时间、发芽温度及淋喷间隔进行优化。在优化条件的基础上，研究不同粒色绿豆萌发过程中养分物质及抗氧化活性物质的变化特征，旨在为高产优质绿豆芽菜的生产及其开发利用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

绿丰2号绿豆（绿色种皮）、保绿200520-2（黑色种皮）：西北农林科技大学小宗粮豆课题组提供。

蒽酮、3，5-二硝基水杨酸：国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸、氢氧化钠、丙酮：洛阳昊华化学试剂有限公司；硫酸铜、硫酸钾：广东省化学试剂工程技术研究开发中心；植物类黄酮含量检测试剂盒、植物总酚含量检测试剂盒、DPPH自由基清除能力检测试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；葡萄糖、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250、无水乙醇、没食子酸：成都科隆化学品有限公司；以上化学试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器与设备

FW-100D高速万能粉碎机：天津鑫博得仪器有限公司；TDL-5A离心机：上海菲恰尔分析仪器有限公司；Bluestar B紫外可见分光光度计：北京莱伯泰科仪器股份有限公司；DK-S26电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；XW-80A旋涡混合仪：海门市其林贝尔制造有限公司；K9860全自动凯氏定氮仪：济南海能科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 绿豆发芽基本条件

挑选色泽光亮、饱满未破损的籽粒，用75%的酒精消毒5 min，将酒精沥干后将籽粒转移至蒸馏水清洗3次，然后在 25℃、黑暗条件下用蒸馏水（1∶10 g/mL）浸泡9 h。将含水的种子单层平铺在覆有纱布的托盘上。托盘置于发芽机中，黑暗培养，平均温度为24℃。每8h用蒸馏水清洗一次豆芽。每个品种发芽3份。培养96 h后收获绿豆芽菜，进行绿豆芽菜的芽豆比测定，芽豆比=绿豆籽粒质量（g）/豆芽质量（g）。

1.2.2 单因素试验

1.2.2.1 浸泡时间对豆芽芽豆比的影响

以发芽平均温度24℃，淋喷间隔8 h，浸泡0、3、6、9、12 h为发芽条件在发芽机内发芽，使种子保持湿润状态，发芽至96 h取出，考察浸泡时间对芽豆比的影响。

1.2.2.2 发芽温度对豆芽芽豆比的影响

以浸泡时间9 h，淋喷间隔8 h，平均温度20、22、24、26、28℃为发芽条件在发芽机内发芽，使种子保持湿润状态，发芽至96 h取出，考察发芽温度对芽豆比的影响。

1.2.2.3 淋喷间隔对豆芽芽豆比的影响

以浸泡时间9 h，平均温度24℃，淋喷间隔2、4、6、8、10 h为发芽条件在发芽机内发芽，使种子保持湿润状态，发芽至96 h取出，考察淋喷间隔对芽豆比的影响。

1.2.3 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，选择发芽温度、浸泡时间和淋喷间隔为自变量，以芽豆比为响应值，根据Box-Behnken设计原理，采用三因素三水平响应面分析法进行试验设计，优化绿豆发芽条件。响应面优化试验因素水平见表1。

表1 响应面优化试验因素水平Table 1 Factors and levels of response surface optimization test design

1.3 营养品质和功能成分指标测定

在优化的最佳条件下发芽，每个品种发芽3份，每隔24 h取样一次，直到绿豆芽菜形成的96 h，去根去皮后烘干磨粉，过80目筛，置于-20℃冰箱待测。

淀粉含量：采用蒽酮比色法[15]进行测定；可溶性糖含量：采用蒽酮比色法[15]进行测定；蛋白质含量：参考GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[16]；可溶性蛋白含量：采用考马斯亮蓝法[15]；DPPH自由基清除率测定、总酚含量测定、总黄酮含量测定：均采用试剂盒测定。

总酚、总黄酮及DPPH自由基提取液的制备：在离心管中加入0.5 g脱脂后的样品，加入5 mL 70%丙酮，将混合物150 r/min振荡摇动3 h后，以4 000 r/min将提取物离心分离10 min，并将上清液移至10 mL离心管。将残余物进行第二次萃取。将两次提取物合并，并在-4℃下储存。每个处理3次重复。

1.4 数据处理

每组试验均重复3次，数据统计分析采用Design-Expert 8.0.6.1和SPSS 22.0软件，P＜0.05有统计学意义，origin 2021作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 浸泡时间对芽豆比的影响

浸泡时间对芽豆比的影响见图1。

图1 浸泡时间对芽豆比的影响Fig.1 Effect of soaking time on sprout bean ratio

如图1所示，随浸泡时间的延长，不同粒色绿豆发芽后的芽豆比均呈现先升高后降低的趋势，其中黑皮绿豆浸泡6 h芽豆比最高，绿皮绿豆浸泡9 h芽豆比最高。其原因可能为，绿豆萌发前期进行浸泡处理的时间长短直接影响绿豆芽菜的产量及品质，通过浸种处理可以软化细胞壁、增强种皮通透性、解除籽粒休眠，同时还可以减少绿豆所含的单宁含量，降低胰蛋白酶抑制剂活性[17-18]。浸泡时间较短则达不到软化种皮的目的，胚轴很难突破种皮伸长导致芽豆比下降，但浸泡时间过长则会导致绿豆籽粒中的营养成分过度流失。因此，浸泡时间选择9 h较为合适。

2.1.2 发芽温度对芽豆比的影响

发芽温度对芽豆比的影响见图2。

图2 发芽温度对芽豆比的影响Fig.2 Effect of germination temperature on sprout bean ratio

如图2所示，黑皮绿豆的芽豆比随发芽温度的上升呈现上升-下降-上升的趋势，绿皮绿豆呈现先上升后下降的趋势，整体而言发芽温度为24℃～28℃芽豆比得到了明显的提升。随着发芽温度的升高，芽体内的酶活力增加，呼吸作用加强，物质分解、转换和运输速率加快，有利于芽体细胞的伸长和扩大，使豆芽生长迅速[19]。在20℃～22℃时芽豆比增长缓慢，可能是由于温度相对较低限制了酶的活性，细胞分裂和生长的速度缓慢。因此，发芽温度选择26℃左右。

2.1.3 淋喷间隔对芽豆比的影响

淋喷间隔对芽豆比的影响见图3。

图3 淋喷间隔对芽豆比的影响Fig.3 Effect of spraying interval on sprout bean ratio

如图3所示，两个品种的绿豆芽豆比均在每6 h淋喷一次时获得最大芽豆比。淋喷间隔过长则导致产量下降，究其原因为豆芽需水量得不到满足，从而延缓物质转运速率，限制豆芽的生长；淋喷间隔时间短，供水充足导致氧气浓度过低，豆芽中激素类物质的活性受到抑制，水溶性物质流失过多，营养品质下降，限制豆芽的生长。因此，淋喷间隔选择4 h～8 h较为合适。

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面试验设计与结果

根据单因素试验结果，选择发芽温度、浸泡时间和淋喷间隔3个因素和水平，采用三因素三水平响应面优化试验，其设计和结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计与结果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

2.2.2 响应面回归方程的建立及检验

运用Design-Expert 8.0.6.1软件对表2的试验结果进行二元多项回归拟合，得到绿豆芽豆比（Y）对浸泡时间（A）、发芽温度（B）、淋喷间隔（C）的二元多项回归方程如下。

黑皮绿豆：Y1=5.92-0.091A-0.34B+0.097C+0.075AB-0.28AC+0.18BC-0.51A2-0.45B2-0.25C2；绿皮绿豆：Y2=7.54-0.13A-0.27B+0.17C-0.058AB-0.56AC+0.24BC-0.88A2-1.18B2-0.24C2。

黑皮绿豆方差分析见表3，黑皮绿豆的回归模型P 值＜0.000 1，表现为极显著，失拟项 P=0.051 1＞0.05，表现为差异不显著，确定系数R2=0.982 2，校正系数R2Adj=0.959 3，综合说明该模型对试验拟合度较好，可以对芽豆比进行分析和预测。一次项A、B、C均达到显著水平，由F值可知，影响黑皮绿豆芽豆比的因素顺序为：B（发芽温度）＞C（淋喷间隔）＞A（浸泡时间），因素AC、BC、A2、B2、C2对芽豆比有极显著影响，因素 AB 对芽豆比的影响不显著。

表3 黑皮绿豆回归方差分析Table 3 Analysis of variance of bivariate regression equation of black mung bean

绿皮绿豆方差分析见表4，回归模型P值＜0.000 1，表现为极显著，失拟项 P=0.072 3＞0.05，表现为差异不显著，确定系数R2=0.989 3，校正系数R2Adj=0.975 6，综合说明该模型对试验拟合度较好，可以对芽豆比进行分析和预测。方差分析中A、B、C对芽豆比影响是显著的，由F值可知，影响绿皮绿豆芽豆比的因素顺序为：B（发芽温度）>C（淋喷间隔）>A（浸泡时间），因素 AC、BC、A2、B2、C2对芽豆比有显著影响，因素 AB对芽豆比的影响不显著。

表4 绿皮绿豆回归方差分析Table 4 Analysis of variance of bivariate regression equation of green mung bean

2.2.3 响应面交互作用分析

各因素交互作用对黑皮绿豆、绿皮绿豆芽豆比影响的响应面图见图4。

图4 各因素交互作用的响应面图Fig.4 Response surface diagram of the interaction of various factors

从响应面的等高线中可以看出，椭圆形即表示因素两两交互作用显著，而圆形则相反。响应面的坡度变化反映出各因素变化时对应响应值的变化情况。图4（a）等高线为圆形，即发芽温度与浸泡时间的交互作用不显著；由图4（b）可知，当淋喷间隔一致时，芽豆比随浸泡时间的升高显著增加后下降，当两者达到适宜条件时得到最佳效果；由图4（c）可知，等高线为椭圆，淋喷间隔与发芽温度的交互作用极其显著，当淋喷间隔保持不变时，芽豆比随发芽温度的升高呈现缓慢上升后急剧下降的趋势，当两者达到适宜条件时得到最佳效果。图4（d）等高线为圆形，即发芽温度与浸泡时间的交互作用不显著；如图4（e）所示，当淋喷间隔一致时，芽豆比随浸泡时间的升高显著增加后下降，当两者达到适宜条件时得到最佳效果；图4（f）等高线为椭圆形，因此淋喷间隔与发芽温度之间的交互作用对芽豆比的影响显著，当两者在适宜条件下对芽豆比的影响达到最大。

根据响应面优化分析得到不同种皮颜色绿豆发芽获得最大经济效益的最佳条件：黑皮绿豆浸泡时间为8.52 h，发芽温度为25.28℃，淋喷间隔为6.31 h，此时芽豆比可获最大值为5.99，根据试验的可行性调整浸泡时间为9 h，发芽温度为25℃，淋喷间隔为6 h，重复试验3次，芽豆比平均值为5.80，拟合性较好；绿皮绿豆浸泡时间为11.35 h，发芽温度为25.59℃，淋喷间隔为4.65 h，此时芽豆比可获最大值为7.02，根据试验的可行性调整为浸泡时间为11 h，发芽温度为26℃，淋喷间隔为5 h，重复试验3次，芽豆比平均值为6.83，拟合性较好。

2.3 绿豆萌发过程中抗氧化活性物质变化

绿豆萌发过程中抗氧化活性物质变化见图5、图6。

图5 黑皮绿豆萌发过程中抗氧化活性物质变化Fig.5 Changes of antioxidant substances in black mung bean during germination

图6 绿皮绿豆萌发过程中抗氧化活性物质变化Fig.6 Changes of antioxidant substances in green mung bean during germination

2.3.1 总酚含量

酚类物质是植物次生代谢的产物，为植物的生长和繁殖提供必要的能量[20-21]。流行病学研究表明，人类饮食中的酚类化合物可能有降低慢性病风险的益处[22]。由图5和图6可知，黑皮绿豆发芽过程中总酚含量变化呈先下降后上升趋势，在萌发96 h达到最大为4.63 mg GAE/g，相较未萌发的绿豆，总酚含量增加1.45倍。绿皮绿豆不同发芽时期总酚含量差异显著，随萌发时间的延长呈现先上升后下降再上升的趋势，72 h的总酚含量低于48 h，尽管含量有所下降但是仍比未萌发种子高出29.7%，96 h多酚含量达到峰值，含量为6.25 mg GAE/g，此时总酚含量是未萌发绿豆籽粒的2.04倍。Cevallos等[23]的研究中表明，黄豆发芽萌发到96 h时总酚含量增加近1.6倍。

2.3.2 总黄酮含量

黄酮类化合物是酚类化合物家族中的一个主要类别，具有抗氧化性和生物活性，黄酮类化合物已在水果、蔬菜和其他植物性食物中得到鉴定。黄酮与降低主要慢性疾病的风险有关[12]。由图5和图6可知，黑皮绿豆发芽过程中总黄酮变化趋势呈先下降后上升的趋势，在发芽96 h达到最大为4.14 mg RE/g，是未萌发绿豆的1.06倍。绿皮绿豆萌发后总黄酮含量变化趋势与黑皮绿豆基本保持一致，发芽24 h急剧下降，此时总黄酮含量相较未发芽绿豆减少了34%，发芽48 h～96 h总黄酮含量逐渐上升，在96 h达到最大值为5.16 mg RE/g，是未萌发绿豆的1.58倍。

2.3.3 DPPH自由基清除率

由图5、图6可知，黑皮绿豆自由基清除率在发芽24 h逐渐降低，第48 h急剧上升，72 h含量下降后又急剧上升，呈“W”型变化趋势，96h含量高达43.21%，整个萌发过程自由基清除率相较未萌发绿豆高出2.86倍。绿皮绿豆发芽24 h～48 h自由基清除率急剧上升，整体呈现快-慢-快的上升趋势，96 h自由基清除率达到最大，为47.75%，相比于未发芽绿豆高出5.5倍。Huang等[24]研究表明绿豆芽菜DPPH自由基清除率要高于大豆芽。

2.4 绿豆萌发过程中营养物质变化

2.4.1 淀粉及可溶性糖含量

绿豆萌发过程中淀粉及可溶糖含量变化见图7。

图7 不同品种绿豆萌发过程中可溶性糖与淀粉含量变化Fig.7 Changes of soluble sugar and starch content in different varieties of mung bean during

由图7可知，黑皮绿豆的淀粉在发芽72 h有显著上升趋势，随后淀粉含量急剧下降。该变化趋势与赵天瑶等[25]研究结果一致。在发芽96 h黑皮绿豆淀粉含量高于绿皮绿豆。绿皮绿豆在发芽24 h相比未发芽的绿豆淀粉含量显著升高，此后淀粉含量逐渐下降。不同颜色的绿豆萌发过程中可溶性糖含量呈现平缓上升的变化趋势，萌发96 h可溶性糖含量分别为17.34%和20.71%，相较未发芽绿豆增加51.6%和40.5%。

2.4.2 蛋白质及可溶性蛋白含量变化

绿豆萌发过程中蛋白质及可溶性蛋白含量的变化见图8。

图8 不同品种绿豆萌发过程中可溶性蛋白与蛋白质含量变化Fig.8 Changes of soluble protein and protein content in different varieties of mung bean during germination

从图8可以看出，不同颜色的绿豆随萌发时间的延长，豆芽的可溶性蛋白的含量逐渐降低，萌发96 h下降速度达到峰值。此时两个品种的绿豆芽菜可溶性蛋白最低值为18.2 mg/g和19.6 mg/g，分别较未萌发绿豆下降59.8%和53.2%。相反，黑皮绿豆和绿皮绿豆粗蛋白质含量随时间延长呈上升趋势，萌发96 h时蛋白质含量达到峰值为32.1 g/100 g和33 g/100 g，此结果与赵天瑶等[25]与高立城等[26]得到的芽苗菜在发芽96 h蛋白质含量逐渐增加的结果基本相似。此外，绿皮绿豆的蛋白质含量高于黑皮绿豆，但是绿皮绿豆的可溶性蛋白含量低于黑皮绿豆。

3 讨论

本试验对最佳发芽条件优化后发现两个粒色的绿豆的最佳发芽条件存在差异，究其原因可能由于两者的基因型存在较大差异。此外，黑皮绿豆的籽粒较大，种皮相对较厚，对于水分的需求高于绿皮绿豆，因此浸泡时间，发芽温度与淋喷间隔均大于绿皮绿豆。

本试验对绿豆萌发过程中抗氧化活性物质测定后发现，不同粒色绿豆随萌发延长总酚含量逐渐上升，酚类物质的合成可能是为了满足自身结构生长和对环境中不利因子的抵抗作用所需。绿豆籽粒发芽后总酚含量的增加可能由于咖啡酸、阿魏酸、没食子酸、对香豆素等酚类化合物含量的升高所致。有研究表明绿皮绿豆芽菜比黑皮绿豆芽菜合成和积累酚类化合物的速度更快，这与本研究结果一致。其原因可能是因为绿皮绿豆苯丙氨酸解氨酶的活性更高，诱导合成肉桂酸从而增加了酚类物质的含量[27]；不同品种的绿豆总黄酮含量为4.14 mg RE/g和5.16 mg RE/g，曹菲菲等[28]在20℃下进行绿豆发芽试验测定96 h时总黄酮含量为2.8 mg/g，小于本试验总黄酮含量，其原因可能由于品种不同，或发芽温度过低限制黄酮合成物质的产生从而引起含量过低；DPPH自由基含量在发芽96 h显著增加，Huang等[24]试验表明，绿豆萌发后DPPH自由基清除率较未萌发绿豆高出260%，与本试验结果有较大偏差，或因为测定方法不同导致。此外，绿皮绿豆芽菜的抗氧化能力与黑皮绿豆芽菜的抗氧化能力不同，这可能部分是由于芦丁仅存在于绿皮绿豆牙菜中以及绿皮绿豆中其他抗氧化酚的快速合成导致[29]。

通过研究绿豆萌发过程中营养物质变化发现，在发芽进行到24 h时淀粉与可溶性糖的含量都在上升。此后，淀粉与可溶性糖的变化基本呈相反趋势，原因可能是在发芽初始阶段脂肪不断被降解并转化为糖类物质，导致淀粉含量上升；随着发芽时间延长，芽体增长迅速，种子呼吸作用加强，脂肪的降解速率降低，胚乳中的干物质转化为可溶性物质，淀粉酶等水解酶类活性增强，淀粉被降解为可溶性糖等小分子糖类化合物，为呼吸等生理活动提供了充足的底物，以免本身的渗透调节机制免遭破坏，维持豆芽正常生长[30-31]。这两种生理变化使得前期淀粉与可溶性糖含量增加，而后期可溶性糖的转化率不断增加，淀粉含量逐渐下降[32]；同时可溶性蛋白与粗蛋白质含量也呈相反的趋势变化。本研究中两个品种的绿豆可溶性蛋白含量逐渐下降，而蛋白质含量逐渐升高，主要原因为蛋白质主要在蛋白质合成酶作用逐渐将可溶性蛋白转化为蛋白质。Khalil等[33]报道称发芽的鹰嘴豆发芽后碳水化合物主要作为萌发时期的底物被消耗，而发芽引起的蛋白酶含量增加导致蛋白质水平的增加。