表没食子儿茶素没食子酸酯抑制MAPK/NF-κB通路减轻脂多糖诱导的RAW 264.7细胞炎症反应

邹 俊，杜逸亭

(电子科技大学医学院附属妇女儿童医院·成都市妇女儿童中心医院 急诊科，四川 成都 610073)

炎症是宿主免疫反应的重要适应性机制，通常由细胞损伤和毒素引起[1]。过度和连续的炎症可导致严重的组织损伤，最终对宿主造成严重损害，如肝炎、肺炎、感染性休克和类风湿性关节炎等[2]。正常的炎症反应是自限性的，通过促炎因子的下调和抗炎因子的上调来维持机体的稳态[3]。因此，靶向失调的炎症过程和调节炎症因子是控制炎症性疾病的有效治疗方法。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是一种从茶叶中分离出来的儿茶素单体，具有抗炎的作用[4]。EGCG发挥其抗炎活性的主要方式之一是调节许多信号通路[5-6]，已有研究表明EGCG通过抑制cGAS/Sting/NLRP3通路来降低H2O2诱导的髓核细胞的炎症反应[7]。丝裂原活化蛋白激酶/核因子κB(MAPK/NF-κB)通路是参与炎症反应的重要通路之一[8]，已有研究显示抑制MAPK/NF-κB通路可减轻脂多糖诱导的关节软骨细胞的炎症反应[9]。但EGCG能否通过调控MAPK/NF-κB通路来参与炎症反应尚不清楚。脂多糖(LPS)是一种内毒素，可诱导巨噬细胞产生炎性因子及炎性介质，利用LPS诱导RAW264.7巨噬细胞以构建炎症细胞模型，是评价药物抗炎活性以及进行机制研究的常用细胞模型之一[10-11]。因此，本研究利用LPS诱导RAW 264.7细胞构建体外细胞炎症模型，观察EGCG对LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应的影响，并探讨其作用机制，以期为EGCG在炎症性疾病中的使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞来源 RAW 264.7细胞(货号：CM-M056)购自通派(上海)生物科技有限公司。

1.2 试剂与仪器 EGCG(纯度≥95%)、LPS购自美国Sigm-Aldrich公司；地塞米松(DEX)购自上海亚培生物科技有限公司；MAPK/NF-κB通路激活剂Anisomycin购自美国MedChemExpress公司；MTT检测试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)、DMEM培养基均购自美国Bio-Rad公司；BCA试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 ELISA试剂盒均购自上海恒远生物科技有限公司；iNOS、COX-2、p-p38、p-IκBα、p-NF-κB、p38、IκBα、NF-κB、GAPDH兔多克隆抗体(anti-iNOS、anti-COX-2、anti-p-p38、anti-p-IκBα、anti-p-NF-κB、anti-p38、anti-IκBα、anti-NF-κB、anti-GAPDH)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗均购自美国CST公司；CO2培养箱购自购自上海润度生物科技有限公司；凝胶成像系统购自南京贝登医疗股份有限公司。

1.3 细胞培养及分组 将RAW264.7细胞培养在DMEM培养基中，该培养基中含有10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，然后在37℃、5% CO2培养箱中加湿培养。每隔1天换1次培养液，进行常规传代培养，取传代到第3代的细胞用于实验。取对数生长期的RAW264.7细胞，消化后调整细胞浓度为5×106个/mL，并接种于6孔板中，培养20 h后换含0.5% FBS的DMEM培养基，继续培养24 h使细胞生长同步化，然后参照文献[12-14]及前期预实验结果，根据不同浓度 EGCG 预处理对 LPS 诱导的巨噬细胞形态、炎症因子、iNOS 等释放及MAPK/NF-κB通路相关蛋白表达的影响将细胞分为：对照组、LPS(1 μg/mL)组、LPS+EGCG-L(12.5 μmol/L)组、LPS+EGCG-M(25 μmol/L)组、LPS+EGCG-H(50 μmol/L)组、LPS+DEX(阳性对照，0.5 μg/mL)组。根据MAPK/NF-κB通路激活剂Anisomycin逆转高剂量EGCG对LPS诱导巨噬细胞炎症反应的抑制作用将细胞分为LPS+EGCG-H组、LPS+EGCG-H+Anisomycin(300 ng/mL)组，所有细胞在添加对应的药物处理1 h后，再加入100 μL 1 μg/mL LPS，培养24 h后，进行后续相关实验。

1.4 检测项目 ①RAW264.7细胞形态观察。收集各组细胞，利用倒置显微镜(型号：NIB900-FL，上海悌可光电科技有限公司)观察各组细胞的形态特征。②MTT法检测细胞增殖。将RAW264.7细胞以1×106个/100 μL 接种到96孔板中，其中调零组添加100 μL完全培养基，37℃孵育24 h，向每孔中加入100 μL MTT溶液，37℃ 孵育4 h，除去上清，每孔中加入150 μL DMSO，于摇床上摇晃10 min后，使用酶标仪检测590 nm波长处的吸光度。细胞存活率=(OD实验组-OD调零组)/(OD对照组-OD调零组)×100%。③Griess法检测细胞上清中NO含量。收集各组细胞上清液50 μL于96孔板中，向上清中加入50 μL Griess A和50 μL Griess B试剂，室温避光10 min。利用酶标仪检测540 nm处的吸光度，NO含量由亚硝酸盐标准曲线计算。每个样品设置6个复孔。④ELISA法检测各组细胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的表达。严格按照TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 ELISA试剂盒操作说明操作步骤对各组细胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的表达进行检测。每个样品设置6个复孔。⑤Western Blot检测iNOS、COX-2蛋白及MAPK/NF-κB通路相关蛋白的表达。利用蛋白提取试剂盒提取细胞中的总蛋白。将等量蛋白质经电泳、转膜、封闭后，加入一抗iNOS、COX-2、p-p38、p-IκBα、p-NF-κB、p38、IκBα、NF-κB、GAPDH在4℃下孵育过夜。次日，将膜与HRP标记的羊抗兔二抗在室温下孵育1 h。使用ECL发光试剂盒检测蛋白条带。ImageJ软件用于进行灰度值分析。每个样品设置6个复孔。

2 结果

2.1 不同浓度EGCG预处理对RAW 264.7细胞形态特征的影响 对照组RAW 264.7细胞形态正常，呈圆形或椭圆形；LPS组RAW 264.7细胞形态发生明显改变，呈梭形或伸出伪足等；与LPS组比较，LPS+EGCG-L组、LPS+EGCG-M组、LPS+EGCG-H组、LPS+DEX组RAW 264.7细胞形态逐渐趋于正常，且随着EGCG浓度的升高，RAW 264.7细胞呈圆形或椭圆形的状态越明显(见图1)。

A：对照组；B：LPS组；C：LPS+EGCG-L组；D：LPS+EGCG-M组；E：LPS+EGCG-H组；F：LPS+DEX组。

2.2 不同浓度EGCG预处理对RAW 264.7细胞活力的影响 经不同处理的RAW 264.7细胞的存活率均大于92%，说明12.5、25、50 μmol/L EGCG对RAW 264.7细胞无毒性作用(见表1)。

表1 EGCG对各组RAW 264.7细胞存活率的影响

2.3 不同浓度EGCG预处理对LPS诱导的RAW 264.7细胞中NO含量的影响 与对照组比较，LPS组RAW 264.7细胞中NO含量显著升高(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+EGCG-L组、LPS+EGCG-M组、LPS+EGCG-H组、LPS+DEX组RAW 264.7细胞中NO含量显著降低，且EGCG浓度越高，RAW 264.7细胞中NO含量越低(见表2)。

表2 EGCG对LPS诱导的RAW 264.7细胞中NO含量的影响

2.4 不同浓度EGCG预处理对LPS诱导的RAW 264.7细胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10水平的影响 与对照组比较，LPS组RAW 264.7细胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著升高，IL-10水平显著降低(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+EGCG-L组、LPS+EGCG-M组、LPS+EGCG-H组、LPS+DEX组RAW 264.7细胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著降低，IL-10水平显著升高(P<0.05)，且EGCG浓度越高，RAW 264.7细胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平越低，IL-10水平越高(见表3)。

表3 EGCG对LPS诱导的RAW 264.7细胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10水平的影响

2.5 不同浓度EGCG预处理对LPS诱导的RAW 264.7细胞中iNOS、COX-2蛋白表达的影响 与对照组比较，LPS组RAW 264.7细胞中iNOS、COX-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+EGCG-L组、LPS+EGCG-M组、LPS+EGCG-H组、LPS+DEX组RAW 264.7细胞中iNOS、COX-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，且EGCG浓度越高，iNOS、COX-2蛋白表达水平越低(见图2，表4)。

表4 各组RAW 264.7细胞中iNOS、COX-2蛋白表达比较

A：对照组；B：LPS组；C：LPS+EGCG-L组；D：LPS+EGCG-M组；E：LPS+EGCG-H组；F：LPS+DEX组。

2.6 不同浓度EGCG预处理对LPS诱导的RAW 264.7细胞中MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响 与对照组比较，LPS组RAW 264.7细胞中p-p38、p-IκBα、p-NF-κB蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+EGCG-L组、LPS+EGCG-M组、LPS+EGCG-H组、LPS+DEX组RAW 264.7细胞中p-p38、p-IκBα、p-NF-κB蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，且EGCG浓度越高，p-p38、p-IκBα、p-NF-κB蛋白表达水平越低。由于高浓度EGCG对MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白表达及LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应的抑制作用最显著，因此，后续选用MAPK/NF-κB通路激活剂Anisomycin来干预LPS+EGCG-H组，以验证Anisomycin能否逆转高剂量EGCG对LPS诱导巨噬细胞炎症反应的抑制作用(见图3，表5)。

A：对照组；B：LPS组；C：LPS+EGCG-L组；D：LPS+EGCG-M组；E：LPS+EGCG-H组；F：LPS+DEX组。

表5 各组RAW 264.7细胞中p-p38、p-IκBα、p-NF-κB蛋白表达比较

2.7 MAPK/NF-κB通路激活剂Anisomycin逆转高剂量EGCG对LPS诱导巨噬细胞炎症反应的抑制作用 与LPS+EGCG-H组比较，LPS+EGCG-H+Anisomycin组RAW 264.7细胞中p-p38、p-IκBα、p-NF-κB、COX-2、iNOS蛋白表达水平及细胞上清中NO含量、TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著升高，IL-10水平显著降低(P<0.05)，RAW 264.7细胞有少量呈梭形、细胞形态发生改变(见图4、5、表6、7)。

A：LPS+EGCG-H组；B：LPS+EGCG-H+Anisomycin组。

图5 倒置显微镜观察RAW 264.7细胞形态

表6 RAW 264.7细胞中p-p38、p-IκBα、p-NF-κB、COX-2、iNOS蛋白表达比较

表7 RAW 264.7细胞中NO含量及细胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10水平比较

3 讨论

炎症具有肿胀、发红、发热和经常疼痛的典型特征，是对损伤、组织缺血、自身免疫反应或感染因子的关键防御反应，也是自身免疫性疾病机体损伤的主要促成因素[15]。小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系是白血病小鼠体内的一种单核巨噬细胞，LPS刺激的巨噬细胞能诱导大量炎症介质(NO)和炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10)以及iNOS、COX-2的产生[16]。TNF-α和IL-1β是由巨噬细胞分泌，可加重炎症反应的因子，IL-6为主要的促炎细胞因子，IL-10具有多种免疫功能，可以抑制炎症和细胞免疫反应，它们在炎症反应的调控中起着重要的作用[17]。COX-2作为一种诱导酶，可调节炎症介质NO和iNOS的合成与释放，加重机体炎症[18]。本研究结果显示，与对照组比较，LPS处理的RAW264.7细胞形态呈梭形，细胞中NO含量及iNOS、COX-2蛋白显著升高，细胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β表达显著升高，IL-10表达显著降低，提示LPS诱导的RAW264.7细胞体外炎症模型构建成功。

EGCG是绿茶多酚的主要成分，其具有重要的抗菌、抗病毒、抗氧化、抗动脉硬化、抗血栓形成、抗血管生成、抗炎和抗肿瘤作用[19]。近年来，关于EGCG在炎症反应中发挥抗炎作用的研究越来越多。Wang等[20]报道EGCG通过其抗炎作用对LPS诱导的急性肺损伤小鼠起保护作用；王友元等[21]表明EGCG通过TLR4调节的NF-κB途径对炎症细胞因子进行负调节，对LPS诱导的小鼠子宫内膜炎具有缓解作用；赵悦伶等[22]发现EGCG能够抑制炎症因子分泌，减少由肠道炎症引起的小鼠全身性炎症反应，对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠炎症性肠病起到一定的保护作用。本研究结果显示，EGCG可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应，提示EGCG可抑制炎症反应，这与上述的研究结果是一致的。表明EGCG是一种可产生抗炎作用的药物，对于炎症性疾病的治疗具有广阔的应用前景。然而本研究只是在体外细胞水平上证明了EGCG的抗炎作用，而关于EGCG在体内能否产生同等效应尚需后续实验进一步探究。

MAPK/NF-κB信号通路参与控制各种促炎基因的激活，导致促炎细胞因子以及重要的炎症蛋白如COX-2和iNOS的产生，进而加重炎症性疾病[23]。据报道，橄榄油多酚通过抑制MAPK/NF-κB通路减轻氧甾醇诱导的肠细胞的促炎反应[24]；BML-111通过抑制p38 MAPK/NF-κB通路活化促进肠缺血再灌注早期肺损伤炎症消退[25]。而EGCG能否调控MAPK/NF-κB通路发挥抗炎作用尚不清楚。本研究结果显示，EGCG可以下调MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白p-p38、p-IκBα、p-NF-κB的表达，且呈浓度依赖效应，提示EGCG可能通过抑制MAPK/NF-κB信号通路对LPS诱导的RAW264.7细胞发挥抗炎作用。为了验证EGCG的调控机制，本研究利用MAPK/NF-κB信号通路激活剂Anisomycin进行干预，结果发现Anisomycin可以逆转EGCG对LPS诱导的RAW264.7细胞的抗炎作用，证实了EGCG是通过抑制MAPK/NF-κB信号通路对LPS诱导的RAW264.7细胞发挥抗炎作用。本研究以MAPK/NF-κB信号通路为切入点，探讨了EGCG的抗炎机制，证实了EGCG通过抑制MAPK/NF-κB信号通路对LPS诱导的RAW264.7细胞发挥抗炎作用，为EGCG能够应用于临床治疗炎症性疾病奠定理论基础。

综上所述，EGCG可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应，该机制与抑制MAPK/NF-κB信号通路有关。然而，EGCG调节炎症反应涉及的通路较多，有待后续实验进一步探究。