延胡索乙素对高糖诱导H9c2细胞凋亡和氧化应激的抑制作用

蹇明辉，陈文明，张 怡

(1.遵义医科大学附属医院 心血管内科，贵州 遵义 563099；2 遵义医科大学 公共卫生学院卫生毒理学教研室，贵州 遵义 563099)

根据国际糖尿病联盟报告，目前，糖尿病影响着近 42.5亿人[1-2]。糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是与糖尿病相关的主要并发症，最初的特点是左心室舒张期功能障碍和间质纤维化，随后收缩功能障碍和射血分数降低，并最终导致心脏衰竭[3-5]。值得注意的是，心肌细胞凋亡在与 DCM 相关的病理生理机制中起着重要作用。Fas/FasL 信号传导对心肌细胞凋亡至关重要，因为它主要调节 caspase-3[6]。目前，西医主要侧重于血糖控制和心血管疾病相关危险因素的治疗或预防；然而，这些方法并没有从根本上解决心脏功能障碍的问题。

延胡索乙素(l-tetrahydropalmatine，l-THP)是延胡索WT Wang的主要成分，是公认的多巴胺D2受体阻滞剂，具有显著的镇静、催眠和镇痛作用[7]。l-THP还可以阻断钙通道，抑制病原菌，保护脑组织和心血管系统[8-10]。Yu研究发现l-THP显著抑制 CaSr/PLCγ1 通路并保护辐射诱导的肺血管内皮细胞凋亡[11]。本研究通过探索l-THP对高糖诱导的H9c2心肌细胞的凋亡和氧化应激的作用，为中药预防 DCM 提供新的科学证据。

1 材料与方法

1.1 主要药品与试剂 延胡索乙素(成都埃法生物科技有限公司)；低糖 DMEM 培养基、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Gemini公司)；兔抗GAPDH多克隆抗体、兔抗Caspase-3多克隆抗体(美国Proteintech公司)；DyLightTM 800荧光标记的山羊抗兔免疫球蛋白二抗(美国 Cell Signaling Technology 公司)；LDH、SOD和MDA检测试剂盒(江苏南京建成生物工程研究所)。

1.2 主要仪器 3131型CO2细胞培养箱、MULTISKAN型全波长酶标仪、MULTIFUGE型超速冷冻离心机、ST16型低速台式离心机等(美国 Thermo Fisher Scientific公司)；1450型生物超净台(苏州净化设备有限公司)；CKX-41 型倒置荧光显微镜(日本 Olympus公司)；CFX CONNECT型荧光定量PCR系统、凝胶成像系统、Mini PROTEAN®Tetra Cell 型电泳槽(美国Bio-Rad公司)；Milli-Q Advantage 超纯水系统(美国默克公司)；MLS-3780型全自动高压蒸汽灭菌器(日本三羊公司)。

1.3 细胞培养、分组 大鼠H9c2心肌细胞来源于中国医学科学院基础医学研究所细胞培养中心。H9c2心肌细胞在含有10%FBS和1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中饥饿，并在含有5%CO2的37℃ 培养箱培养24h，待细胞融合度达 70%～80%时，以含0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化并进行传代培养。将呈对数生长期的 H9c2 心肌细胞分为5 组：(1)对照组(Control)：5.5 mM 正常葡萄糖；(2)模型组(Model)：30 mM D-葡萄糖；(3)l-THP高剂量组(l-THP-H)：30 mM D-葡萄糖和 100 μg/mLl-THP 的 DMEM 中培养 24 h；(4)l-THP中剂量组(l-THP-M)：30 mM D-葡萄糖和50 μg/mLl-THP 的 DMEM 中培养 24 h；(5)l-THP低剂量组(l-THP-L)：30 mM D-葡萄糖和 25 μg/mLl-THP 的 DMEM 中培养24 h。

1.4 H9c2心肌细胞存活率的检测 通过噻唑蓝(MTT)法检测H9c2细胞的活性，待l-THP处理24 h，收集H9c2细胞，然后用MTT溶液(0.5mg/mL)在37℃培养4 h。采用MULTISKAN型全波长酶标仪，选择波长 490 nm，检测每孔样本的吸光度(OD)值，并计算细胞存活率：细胞存活率(%)=(实验组 OD 值-空白组 OD 值)/(正常组 OD 值-空白组 OD 值)×100%。

1.5 H9c2心肌细胞上清液中LDH、ROS和GSH-PX活性的检测l-THP处理H9c2细胞24 h，收集培养液，在4℃条件下，3 000 r/min，离心10 min，取其上清液，按照试剂盒说明书的方法进行操作，然后采用酶标仪分别检测细胞上清液中LDH、ROS和GSH-PX的活性。

1.6 细胞凋亡测定 Annexinvfitc/PI染色检测H9c2细胞凋亡。在该操作过程中，使用0.05%胰蛋白酶收集H9c2细胞，用4℃磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，然后在浓度为1×105cells/mL的500 μg/mL结合缓冲液中再悬浮。然后在室温下将细胞与膜联蛋白V-FITC(5 μg/mL)和PI(5 μg/mL)在黑暗中培养15 min。

1.7 蛋白质印迹 在l-THP处理H9c2心肌细胞后，收集细胞，提取总蛋白，定量。蛋白变性后，使用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，并转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。使用Tris缓冲盐水(TBS)封闭缓冲液封闭细胞膜，并在4℃下，与一抗Caspase-3多克隆抗体(1∶1 000)孵育过夜。在用Tris缓冲盐水吐温-20(TBST)洗涤膜3次后，将其与HRP结合的二级抗体孵育1 h。使用化学发光增强剂获得抗原-抗体复合物条带，并使用凝胶成像系统分析获得条带强度。Caspase-3与内参GADPH 的蛋白灰度值比值表示蛋白的表达水平，实验重复3次。

1.8 实时PCR 在l-THP处理H9c2心肌细胞24h，收集细胞，使用TRIzol提取总核糖核酸(RNA)，在确定浓度和纯度后，使用高容量cDNA逆转录试剂盒将总RNA逆转录为互补DNA(cDNA)。在实时PCR系统上进行实时定量聚合酶链反应(PCR)，以扩增Fas、Fas-L和GAPDH基因。基因序列：FAS上游引物为5′2TCTAGTTGG AAAGAACCGAAGG2 3′，下游引物为5′ 2TCTAGT TGGAAAGAACCGAAGG2 3′，引物长度为306 bp；

Fas-L：上游引物为5′2GGAATGGGAAGACA CATATGGAACTGC2 3′，下游引物为5′2CATATC TGGCCAGTAGTGCAGTAATTC2 3′，引物长度为237bp；GAPDH：上游引物为5′2AAATCGT2GC GTGACATTAA2 3′，下游引物为5′ 2TCGTC ATACTCCTGCTTG2 3′，引物长度为381 bp。结果用2-ΔΔCT法进行分析，并与对照组进行比较。

2 结果

2.1l-THP提高H9c2心肌细胞的活力 用不同浓度的l-THP 处理高糖诱导的 H9c2心肌细胞 24 h，观察l-THP对H9c2心肌细胞活力的影响。结果如表1所示，Model组H9c2心肌细胞活力明显低于 Control 组(P< 0.05)，与Model组相比，随l-THP浓度增加，H9c2心肌细胞的活力呈剂量依赖性恢复(P< 0.05)。

表1 l-THP对高糖诱导H9c2 心肌细胞存活率的影响

2.2l-THP对 H9c2 心肌细胞 LDH 释放量和氧化应激水平的影响 用不同浓度的l-THP 处理高糖诱导的 H9c2心肌细胞 24 h，观察l-THP对H9c2心肌细胞活力的影响。结果如表2所示，Model组H9c2心肌细胞LDH 释放量明显高于Control 组(P< 0.05)，与Model组相比，H9c2心肌细胞LDH 释放量随l-THP浓度增加，呈剂量依赖性降低(P< 0.05)；Model组H9c2心肌细胞ROS的活性显著高于Control 组(P<0.05)，与Model组相比，H9c2心肌细胞ROS的活性随l-THP浓度增加，呈剂量依赖性降低(P<0.05)；Model组H9c2心肌细胞GSH-PX的活性明显低于Control 组(P<0.05)，与Model组相比，H9c2心肌细胞GSH-PX的活性随l-THP浓度增加，呈剂量依赖性升高。

表2 l-THP对 H9c2细胞 LDH 释放量和氧化应激水平的影响

2.3l-THP对高糖诱导H9c2心肌细胞凋亡的影响 结果如表 3所示，与Control 组相比，Model组H9c2心肌细胞的凋亡率显著增加(P<0.05)；与 Model组相比，l-THP降低了高糖诱导的H9c2心肌细胞的凋亡率，在 25、50、100 μg/mL的浓度下，随l-THP浓度增加，H9c2心肌细胞的凋亡率呈剂量依赖性降低(P<0.05)。

表3 l-THP对高糖诱导H9c2 细胞凋亡的影响

2.4l-THP通过降低 Caspase-3 表达来抑制高糖诱导H9c2心肌细胞的凋亡 为了确定l-THP 介导的高糖诱导H9c2心肌细胞凋亡抑制的机制，我们通过蛋白质印迹检测了细胞凋亡相关蛋白Caspase-3的表达水平。结果如图1所示，Model组的H9c2心肌细胞Caspase-3表达水平明显高于Control 组(P<0.05)，给予l-THP 预处理后，Caspase-3表达水平呈浓度依赖性降低(P<0.05)。因此，l-THP 可能通过下调 Caspase-3 表达来抑制高糖诱导H9c2心肌细胞凋亡。

*：与Control组比较，P<0.05；#：与Model组比较，P<0.05。

2.5l-THP 下调高糖诱导H9c2心肌细胞 Fas 和 FasL mRNA 的表达水平 为了进一步阐明l-THP 介导的细胞凋亡抑制的分子机制，检测了 Fas 和 FasL 基因表达水平。RT-PCR结果表明(见表4)，Model组H9c2心肌细胞Fas和FasL的 mRNA表达水平明显高于Control 组(P<0.05)，与Model组相比，给予l-THP处理后，Fas和FasL mRNA的表达水平明显降低(P<0.05)，然而，25、50 μg/mL的l-THP处理组和Model组之间Fas和FasL mRNA的表达水平无显著差异(P>0.05)。

表4 Real-time PCR 分析H9c2细胞Fas和FasL基因表达水平

3 讨论

氧化应激在糖尿病心肌细胞损伤及DCM的发生发展中起重要作用，细胞内氧化应激产生的ROS与机体内抗氧化防御系统不平衡，过量的活性氧介导细胞蛋白质及核酸损伤，引发细胞凋亡，从而引起组织器官功能障碍[12]。GSH-Px 是机体的清除剂，能特异性地清除过氧自由基、超氧阴离子等，从而减轻ROS造成的损伤[13]。LDH主要存在于细胞内，当细胞受损时，LDH会泄漏至细胞外，故可作为反映细胞损伤程度的指标。本研究发现，l-THP可明显降低高糖诱导的H9c2 心肌细胞上清液中ROS、LDH 的活性，升高GSH-Px 的活性。证实l-THP可通过抗氧化应激作用来减轻高糖对心肌细胞造成的损伤。

心肌细胞异常凋亡是DCM 主要病理特征之一，研究发现，在DCM 发病过程中，异常凋亡的心肌细胞数量不断增加，可导致心肌有效收缩单元不断减少，从而影响心脏功能[14]。Caspase 是一种促使细胞凋亡的酶，在细胞凋亡过程中发挥重要的作用。Caspase-3是细胞凋亡过程中的终末剪切酶，是细胞凋亡的有力执行者，可通过催化细胞基质裂解，加速细胞的凋亡[15]。苦参碱通过下调Caspase-3、Bax和BCL-2等相关凋亡因子的表达，改善高糖诱导的H9C2心肌细胞损伤[16]。研究观察到高糖诱导大鼠H9c2心肌细胞凋亡增加的同时，caspase-3表达增加，给予l-THP干预处理后，能够下调caspase-3表达，减少心肌细胞凋亡。提示，l-THP 对心肌的保护作用可能与抑制caspase-3表达有关。由此表明，l-THP对高糖诱导的心肌细胞损伤可能是通过抗凋亡作用而发挥保护作用。

为了进一步探索l-THP介导抑制高糖诱导H9c2细胞凋亡的分子机制，本研究还对Fas和FasL进行了研究。文献报道，Fas/FasL信号通路可直接触发心肌细胞凋亡，在心血管疾病相关研究中已有报道[17]。值得注意的是，Fas/FasL结合导致细胞内“死亡诱导信号复合物”的积累，这些复合物为Fas介导的凋亡提供了必要的因素。本研究表明，模型组Fas和FasLmRNA表达水平显著上调；给予l-THP干预处理后，Fas和FasLmRNA表达水平明显下调。这表明l-THP减轻细胞凋亡的作用，还可能与下调Fas、FasL的表达有关。

综上所述，l-THP通过调控细胞凋亡相关蛋白和抗氧化应激作用来保护H9c2细胞免受高糖诱导的损伤并提高其生存能力。