RDS合并呼吸机相关性肺炎新生儿肺部菌群多样性分析

田甜， 韦海林， 陆敦， 陆岩

(河池市妇幼保健院儿科，广西省河池市547000)

随着新生儿重症监护室(neonatal intensive care unit,NICU)技术的不断完善，新生儿呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome,RDS)的抢救效果得到明显提高，机械通气等呼吸支持治疗能有效改善其临床症状，但也带来了呼吸机相关性肺炎(ventilator associated pneumonia,VAP)问题，VAP不仅会增加治疗时间与费用，还可导致呼吸系统后遗症[1-3]。了解RDS合并VAP患儿肺部菌群特征，以指导临床抗生素选择，对尽早控制感染、改善患儿预后具有重要意义。随着抗生素的广泛使用致病菌菌种不断变迁，为了解近年VAP患儿肺部主要致病菌及菌群多样性特点，本研究对RDS合并VAP新生儿肺部致病菌分布以及菌群多样性特征进行了分析，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选择本院2017年1月—2021年1月行气管插管RDS新生儿70例，根据是否并发VAP分为VAP组(30例)和对照组(40例)。VAP诊断标准参考文献[4]。纳入标准：符合新生儿RDS诊断标准[5]，患儿具有发生RDS的高危因素，临床有呼吸窘迫相关表现，体格检查可见胸廓扁平，听诊呼吸音低，偶可闻及细湿啰音，联合胸部X线片、血气分析、泡沫试验即可确诊；均参考文献[6]进行RDS评分。排除标准：排除新生儿湿肺、胎粪吸入、产时窒息致RDS，合并呼吸系统先天发育畸形；合并先天性心脏病。本研究经本院伦理委员会批准，家长知情同意。新生儿RDS评分VAP组高于对照组(P<0.05)，两组其他临床资料比较差异无显著性(P>0.05；表1)。

表1 两组临床资料的比较

1.2 细菌分离与鉴定

于患儿机械通气48 h后，应用抗生素治疗前，采集痰液标本，制备痰液震荡液，接种于哥伦比亚血平板与流感嗜血杆菌分离平板，MicroScan WalkAway-40全自动细菌鉴定/药敏测试仪鉴定细菌种属。

1.3 菌群丰度和香农-维纳指数的测定

分别于气管插管第1、2、3、4、5天采集患儿痰液标本。应用细菌微量DNA提取试剂盒提取DNA，PCR扩增反应采用细菌16SrDNA V3区基因片段设计通用引物，引物设计由上海生工公司合成。上游引物5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGG GGCAGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，下游引物5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。反应体系包括DNA原液6 μL，预混液25 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，ddH2O 18 μL。循环程序94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，72 ℃延伸1 min，共循环10次；94 ℃变性30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃延伸1 min，共循环25次；72 ℃延伸7 min。参考文献[7]进行DGGE检测，PCR产物序列为195 bp，采用Decode系统进行DGGE分析。采用Quantity One(BIO-RAD,America)软件对DGGE条带数目(丰度)与相似度进行检测，并将数据导入BIO-DAP软件计算香农-维纳指数[8]。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 两组患儿机械通气和预后情况的比较

VAP组机械通气时间、拔管后吸氧时间、重复插管上机率、死亡率均高于对照组(P<0.05；表2)。

表2 两组患儿机械通气和预后情况的比较

2.2 病原菌分布情况

VAP组30例患儿共检出36株菌株，以革兰氏阴性菌为主；检出率前3位的病原菌分别为肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和肺炎链球菌(表3)。

表3 VAP病原菌分布的情况(n=36) 单位：株(%)

2.3 两组菌群丰度的比较

两组患儿菌群丰度均从治疗第2天即上升，且在第3～5天时维持较高水平，且VAP组第2～4天菌群丰度低于对照组(P<0.05；表4)。

2.4 两组香农-维纳指数的比较

对照组肺部菌群香农-维纳指数从第2天即上升，且在第3～5天维持较高水平，VAP组从第3天开始上升，在第4～5天维持较高水平；且VAP组第2～4天香农-维纳指数显著低于对照组(P<0.05；表5)。

表4 两组患儿菌群丰度的比较

表5 两组患儿痰液菌群香农-维纳指数的比较

3 讨 论

机械通气等呼吸支持治疗可有效改善RDS患儿临床症状，改善患儿预后，但长期使用呼吸机将引起VAP，VAP已成为撤机困难、延长患儿住院时间的主要原因。VAP的发生将增加RDS的治疗难度，并增加不良预后发生风险。本研究中70例RDS患者共30例发生VAP，VAP发生率为42.86%。VAP组患儿死亡率远高于对照组，提示VAP的发生将增加不良预后发生风险，这与谢朝云等[9]研究结论一致。VAP组患儿治疗前RDS评分更高、机械通气时间和拔管后吸氧时间更长，重复插管次数也更多，提示以上因素可能是增加VAP风险的危险因素。

明确VAP常见致病菌，在早期经验性用药和改善患儿预后中具有重要意义。本研究采集VAP组患儿痰液行细菌培养发现，VAP组30例患儿中共检出36株菌株，以革兰氏阴性菌为主，检出率排前3位的病原菌分别为肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和肺炎链球菌，鉴于药敏试验结果，建议临床经验性选择亚胺培南、环丙沙星等药物进行治疗。

既往研究认为，VAP的发病机制主要包括气管插管表面细菌吸入或外界环境中病原菌入侵两方面，且很长一段时间内，肺部被认为是无菌的。随着研究技术的不断进展，高通量测序技术不断促进微生物组学的发展，该认知逐渐被颠覆。16S rRNA是现临床应用范围最广的基因测序技术，可鉴别出不能培养的细菌[10]，Guss等[11]利用16S rRNA技术，在囊性纤维化患者痰液中发现了60多种细菌，提示肺部菌群是一个复杂的微生态系统，且有研究提出，机械通气患者肺部微生态失衡，正常负反馈机制被破坏，是导致感染的重要原因[12]。彭纯颖等[13]研究报道，VAP患儿肺部菌群物种多样性及丰度均发生明显改变。基于以上研究，说明RDS合并VAP患儿也可能存在肺部微生态失衡。

本研究借助16S rRNA技术，对VAP患儿肺部菌群多样性进行研究，并凭借DGGE技术对细菌丰度以及香农-维纳指数进行定量。结果提示，气管插管初期，VAP组患儿及对照组患儿肺部菌群多样性均较低，而随着插管时间的不断延长，两组肺部菌群多样性不断增高，说明随着插管时间的延长，患儿肺部细菌种类逐渐增多。但在插管治疗第2～4天时，感染VAP的患儿肺部菌群丰度明显低于对照组患儿，说明并发VAP患儿肺部细菌多样性具有降低趋势，肺部细菌多样性下降可能是导致VAP的重要原因。在插管第5天，两组肺部菌群丰度以及香农-维纳指数间差异无显著性，可能与随着插管治疗时间的延长，部分VAP患儿病情不断好转，或VAP患儿对抗生素的耐药增加，对照组患儿受到抗生素抑制等因素相关[14-15]。

综上所述，RDS患儿机械通气过程中VAP发生率高，引起VAP的主要致病菌包括肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌以及肺炎链球菌，机械通气过程中肺部菌群多样性降低对提示VAP具有重要警示作用。