丹酚酸A对脂多糖诱导人肾小球系膜细胞凋亡的作用机制研究

冯静，李莉

作者单位：1海口市人民医院全科医学科，海南 海口 570208；2海南医学院第一附属医院血液净化科，海南 海口 570100

肾小球系膜细胞在临床上又被称为球内系膜细胞、血管系膜细胞、间充质细胞、深部内皮细胞、毛细血管细胞，位于肾小球毛细血管袢间，属于一种肾小球固有细胞，其细胞形状不规则，具有产生细胞因子、分泌细胞基质、吞噬或者清除大分子物质、支撑肾小球毛细血管丛的功能［1］。在机体处于正常生理状态下时，肾小球细胞细胞增殖、凋亡处于动态平衡状态，但当机体受到外界因素刺激会导致增殖、凋亡失衡，过度增殖，而肾小球系膜细胞过度增殖是多种进行性肾小球疾病的共同病理基础，抑制肾小球系膜细胞过度增殖可在一定程度上抑制疾病进一步进展［2-3］。丹酚酸A 属于丹参的主要水溶性有效成分之一，目前已有研究证实其具有心肌缺血保护、抗氧化、抗肝纤维化、抗血栓、作用于细胞增殖凋亡等作用［4］。基于此背景，在本研究中分析丹酚酸A 对LPS诱导人肾小球系膜细胞凋亡的作用及作用机制，为临床上抑制肾小球系膜细胞过度增殖的研究提供新方向。

1 材料与方法

1.1 材料研究细胞：人肾小球系膜细胞购自中国科学院细胞库，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

主要试剂及仪器：脂多糖（LPS）（德国德赛公司，批号60067113/1）；胰酶（武汉益普生物科技有限公司，批号CK-E30628）；PI染液（上海经科化学科技有限公司，批号JKMK1509A）；小鼠抗大鼠磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）抗体（深圳市豪地华拓生物科技有限公司，批号PL0402037）；兔抗大鼠蛋白激酶B（AKT）抗体（武汉纯度生物科技有限公司，批号CDB101529A-KT）；小鼠抗大鼠哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抗体（上海钰博生物科技有限公司，批号YB831）；兔抗人胱天蛋白酶-3（caspase-3）抗体（武汉益普生物科技有限公司，批号ATA25878）；兔抗人B 细胞淋巴瘤-2相关X 蛋白（Bax）抗体（武汉菲恩生物科技有限公司，批号FNab10410）；兔抗人B 细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）抗体（武汉菲恩生物科技有限公司，批号FNab00840）。细胞培养箱（美国NUAIRE公司，型号NU4950E）；流式细胞仪［默瑞（上海）生物科技有限公司，型号CytoFLEX S］；荧光显微镜（上海土森视觉科技有限公司，型号DM2500）。

药物来源：丹酚酸A（四川省维克奇生物科技有限公司，批号96574-01-5，批次XY0519，纯度>98%）。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 本研究起止时间为2018年5月至2019年5月。购买华拓生物生产的HGMC人肾小球系膜细胞（货号HT-X1 990），使用含10%胎牛血清的RPMI 1 640培养液在含5%二氧化碳、37 ℃的细胞培养箱中培养人肾小球系膜细胞，第2天换液，当所培养的细胞融合率范围为80%～90%时做传代处理。将细胞随机分为A 组（不做任何处理的人肾小球系膜细胞）、B 组（LPS+人肾小球系膜细胞）、C 组（LPS+人肾小球系膜细胞+低剂量丹酚酸A）、D 组（LPS+人肾小球系膜细胞+中剂量丹酚酸A）、E 组（LPS+人肾小球系膜细胞+高剂量丹酚酸A）。

丹酚酸A 处理：使用5%乙醇做丹酚酸A 溶解，使用0.2 mol/L 的PS 溶液过滤除菌，制备为10 mg/L的低剂量丹酚酸A、20 mg/L 的中剂量丹酚酸A、40 mg/L的高剂量丹酚酸A3个浓度备用。

细胞种板后24 h 更换为无血清培养液，A 组细胞不添加任何药物，B 组、C 组、D 组、E 组细胞培养基中均加入10 mg/L LPS 培养，1 h 后C 组、D 组、E 组分别在细胞培养基中加入低剂量丹酚酸A（10 mg/L）、中剂量丹酚酸A（20 mg/L）、高剂量丹酚酸A（40 mg/L）做细胞培养24 h后做后续试验。

1.2.2细胞增殖检测 使用MTT 比色法检测细胞细胞增殖情况，在细胞培养后将细胞浓度调整至3×104个/毫升，接种于96 孔板中，将200 µL 细胞悬液加入至每孔中，在37 ℃、5%二氧化碳环境下培养24 h、48 h、72 h后，加入10µL 的MTT 试剂继续孵育4 h，采用酶标仪测定波长为570 mm 的细胞组光密度（optical density，OD）值，计算各组细胞增殖率。细胞增殖率=（细胞组OD值/参照组OD值）×100%。

1.2.3细胞凋亡检测 采用TUNEL 法检测细胞凋亡率，在荧光显微镜下对细胞凋亡数进行观察计数，经洗涤、DAPI 染色封片后的细胞核分别呈现为阳性（绿色荧光）和阴性（蓝色荧光），之后计算细胞凋亡率，细胞凋亡指数=阳性细胞数/总细胞数×100%，重复进行3次，取平均值。

1.2.4细胞周期检测 采用流式细胞仪对细胞周期进行检测，取对数生长期的细胞，接种至培养瓶中（每瓶6×105个），使用胰酶消化后收集细胞，利用4 ℃预冷的70%乙醇做细胞重悬固定处理，在4 ℃下孵育过夜，1 000 r/min 离心处理，处理5 min 后将上清吸除，使用PBS重复洗涤2次，将RNA酶加入至500µL 的1×Buffer 重悬细胞，使得终浓度为10 g/L，之后在37 ℃环境下孵育，孵育0.5 h，避光，之后将终浓度为50 m/L 的PI 染液，在4 ℃环境下反应，反应0.5 h，避光，之后将PBS 加入至2 mL，最后采用Dx‑FLEX流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

1.2.5细胞PI3K/AKT/mTOR 信号通路指标表达量检测 采用蛋白质印迹法检测细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达量，将细胞行10 000g离心处理10 min，对上清液进行提取后，BCA进行蛋白定量检测，在2×SDS（十二烷基硫酸钠）凝胶缓冲液中加入50µg蛋白，在100 ℃环境中加热5 min有助于蛋白发生变性。凝胶电泳完、转膜，取膜，4 ℃环境下在5%脱脂牛奶中固定、封闭处理时间为1 h，将一抗使用0.05%～0.1%TBST（等渗盐溶液加三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）给予稀释（p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、cas‑pase-3、Bax、Bcl-2 一抗为1∶1 000），4 ℃孵育过夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST 洗膜，3 次，每次为5 min，二抗被0.05%～0.1%TBST稀释（1∶10 000），摇动孵育时间为1 h，再次采用TBST 连续洗膜3 次，处理时间为5 min，DAB显色，定量分析蛋白表达情况，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参。

1.3 统计学方法采用SPSS 20.0 统计软件进行分析处理。计量资料采用±s描述，多组间比较采用单因素方差分析。两两组间比较采用HSD-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丹酚酸A 对细胞增殖、凋亡的影响与A 组相比，B 组、C 组、D 组、E 组细胞增殖率升高；与B 组相比，C 组、D 组、E 组细胞增殖率降低；与C 组相比，D组、E组细胞增殖率降低；与D组相比，E组细胞增殖率降低；与A组相比，B组细胞凋亡率降低；与A组相比，C 组、D 组、E 组细胞凋亡率升高；与B 组相比，C组、D组、E组细胞凋亡率升高；与C组相比，D组、E组细胞凋亡率升高；与D组相比，E组细胞凋亡率升高，均差异有统计学意义（均P<0.05）。见图1，表1。

图1 肾小球系膜细胞凋亡图（TUNEL染色×40）

表1 丹酚酸A对人肾小球系膜细胞增殖、凋亡的影响/（%，±s）

表1 丹酚酸A对人肾小球系膜细胞增殖、凋亡的影响/（%，±s）

注：①与A 组相比，P<0.05。②与B 组相比，P<0.05。③与C 组相比，P<0.05。④与D组相比，P<0.05。

?

2.2 丹酚酸A对细胞周期的影响与A组相比，B组G0/G1期细胞分布率降低，S期、G2/M期细胞分布率升高；与A组相比，C组、D组、E组组G0/G1期细胞分布率升高，S期、G2/M期细胞分布率降低；与B组相比，C组、D组、E组G0/G1期细胞分布率升高，S期、G2/M期细胞分布率降低；与C组相比，D组、E组G0/G1期细胞分布率升高，S期、G2/M期细胞分布率降低；与D组相比，E组G0/G1期细胞分布率升高，S期、G2/M期细胞分布率降低，均差异有统计学意义（均P<0.05）。见表2。

表2 丹酚酸A对人肾小球系膜细胞周期的影响/（%，±s）

表2 丹酚酸A对人肾小球系膜细胞周期的影响/（%，±s）

注：①与A 组相比，P<0.05。②与B 组相比，P<0.05。③与C 组相比，P<0.05。④与D组相比，P<0.05。

?

2.3 丹酚酸A 对细胞PI3K/AKT/mTOR 信号通路的影响与A 组相比，B 组、C 组、D 组、E 组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、caspase-3、Bcl-2 表达量升高，Bax表达量降低；与B 组相比，C 组、D 组、E 组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、caspase-3、Bcl-2 表达量降低，Bax 表达量升高；与C 组相比，D 组、E 组p-PI3K、p-AKT、pmTOR、caspase-3、Bcl-2 表达量降低，Bax 表达量升高；与D 组相比，E 组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、cas‑pase-3、Bcl-2 表达量降低，Bax 表达量升高，均差异有统计学意义（均P<0.05）。见图2，表3。

表3 丹酚酸A对人肾小球系膜细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响/±s

表3 丹酚酸A对人肾小球系膜细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响/±s

注：①与A组相比，P<0.05。②与B组相比，P<0.05。③与C组相比，P<0.05。④与D组相比，P<0.05。

?

图2 丹酚酸A对人肾小球系膜细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白质印迹图

3 讨论

肾小球系膜细胞属于一种血管平滑肌样细胞，具有多种生理功能，如调节肾血流量、吞噬进入至肾小球的大分子物质、合成系膜基质等，其既是众多病理因子所作用的靶细胞，又是肾小球中活跃度最高的一类细胞，在人机体内肾小球炎症性疾病的组织病理学改变均会导致肾小球细胞细胞过度增殖［5-6］。肾小球系膜细胞异常增殖是多种肾小球疾病的病变基础，异常增殖促使过量的细胞外基质生成、聚集，可引发肾脏纤维化、肾小球硬化、终末期肾功能衰竭等多种疾病的发生，抑制其过度增殖对抑制肾脏疾病进展具有重要的作用［7］。基于此背景，本研究为寻找有效抑制肾小球系膜细胞过度增殖的干预药物，使用LPS 诱导，运用丹酚酸A 干预，分析丹酚酸A 对LPS诱导的肾小球系膜细胞凋亡的影响，并深入研究其作用机制，以抑制肾小球系膜细胞增殖，抑制肾脏疾病进展。

丹参属于我国的一种传统中药，为唇形科植物，其具有抗氧化、扩张血管、促进血液春焕、抗凝血、抗肿瘤、增加心肌供血、改变血液黏滞性、抗菌、消炎等药理作用，丹参的化学成分主要包括水溶性丹酚酸类和脂溶性丹参酮类等，其中丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB 等为脂溶性成分，丹酚酸A、丹酚酸B、原儿茶酸、原儿茶醛等为水溶性成分［8-9］。丹酚酸A 作为丹参的水溶性成分，属于内含多个酚羟基的有机酸类化合物，目前有较多研究分析其药理作用，研究发现，丹酚酸A具有较为广泛的药理活性，包括降血脂、改变血液流变学、扩张血管、抗血小板聚集、抑制脂质过氧化、改变增殖、凋亡失衡等［10-12］。崔勤涛等［13］在其研究中发现，丹酚酸A 可经激活AKT/mTOR/4EBP1信号通路缓解脂多糖诱导的H9c2心肌细胞凋亡和氧化应激。李伟文等［14］在其研究中认为，丹酚酸A 可改变脂多糖诱导人肺微血管内皮细胞线粒体自噬和细胞损伤。上述研究均证实丹酚酸A 与细胞生物学行为相关，本研究结果发现，经LPS干预后的肾小球系膜细胞增殖率较高，凋亡率较低，细胞周期分布异常，说明在LPS的刺激下导致肾小球系膜细胞增殖、凋亡失衡，经丹酚酸A 干预后，肾小球系膜细胞增殖率显著降低，而凋亡率升高，周期分布改变，且呈剂量依赖，此结果提示着，丹酚酸A 可抑制LPS诱导的肾小球系膜增殖，促进凋亡，阻滞细胞周期，最终抑制疾病进一步进展。

临床研究发现，PI3K/AKT/mTOR 信号通路与细胞增长生长、调控细胞增殖、凋亡等生物学行为的关键信号转导通路［15］。近年来随着临床上对肾脏疾病的逐渐深入研究发现，PI3K/AKT/mTOR 信号通路异常参与多种肾脏疾病的发生进展，在机体受到LPS 的刺激下，细胞内的PI3K 被活化，进而激活蛋白激酶B、磷酸肌醇依赖性酶，增加I 型胶原蛋白等指标异常表达，最终诱发肾小球系膜出现炎症反应，最终损伤系膜细胞，破坏其增殖、凋亡之间的动态平衡，导致肾小球系膜细胞异常增殖，进一步加重多种肾脏疾病进展［16-18］。目前临床上已有试验证实，PI3K/AKT/mTOR 信号通路与肾小球系膜细胞病变相关，岳媛等［19］在其研究中认为，乌索酸可经抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路修复高糖诱导的系膜细胞损伤状况，李豫江等［20］同样在其研究中发现，经来氟米特干预可诱导大鼠系膜细胞凋亡，其作用机制与PI3K/Akt/mTOR 信号通路失活相关。张春江等［21］在其研究中证实，PI3K/Akt/mTOR信号通路与肾小球系膜细胞增殖凋亡相关。基于此研究背景，本研究拟认为PI3K/Akt/mTOR 信号通路为丹酚酸A改变LPS诱导的肾小球系膜细胞生物学行为的机制，结果显示，经丹酚酸A干预后PI3K/Akt/mTOR信号通路失活，此结果提示着丹酚酸A 可能经作用于PI3K/Akt/mTOR 信号通路改变LPS 诱导的肾小球系膜细胞生物学行为。

虽然本研究首次证实丹酚酸A 经作用于PI3K/Akt/mTOR信号通路改变LPS诱导的肾小球系膜细胞生物学行为，但目前临床上并未有研究分析丹酚酸A的上述作用，因此本研究上述研究结果还需后续研究进一步分析验证，以期望为临床上研究提供参考。

综上所述，本研究发现丹酚酸A可促进LPS诱导人肾小球系膜细胞凋亡，抑制增殖，阻滞细胞周期进程，其作用机制可能与促使PI3K/AKT/mTOR信号通路失活，调控caspase-3、Bcl-2、Bax凋亡相关蛋白相关。