Box-Behnken 响应面设计联合LS-SVM 数学模型优化经典名方涤痰汤的有效成分提取工艺

陈思邈 李旭冉 张宇燕 金伟锋 陶水良 丁志山 陈伟燕

浙江中医药大学 杭州 310053

涤痰汤源于明代《奇效良方》，组分包含胆南星、橘红、石菖蒲、茯苓、枳实等9味药[1]，具有涤痰开窍、利气补虚之功效，能开窍醒神治其标；同时补气渗湿化痰，使湿无所聚，痰无所生，以固其本[2]，主治中风、痰迷心窍、舌强不能言。 临床加减化裁后常用于中风[3]、抑郁[4]、痴呆[5]，以及冠心病[6]、肺部疾病[7-8]等属于痰涎壅盛的疾病的治疗， 均取得了较好的临床疗效。现代临床用药通常保留经典涤痰汤组方中橘红、枳实、石菖蒲等组分[9-12]。研究也表明这些延用药物及其有效成分均具有较强的药理作用，如橘红、枳实中的辛弗林、新橙皮苷等能促进脂质代谢[13-14]；橙皮苷具有抗病毒、抗菌、消炎、抗氧化等作用[15]，石菖蒲挥发油中的α-细辛醚、β-细辛醚等能显著抗栓塞，保护心肌、血管细胞，改善血管功能等[16]。这些活性物质在复方疗效中起了重要作用，在中药材、中药提取物、中药制剂研究中常作为指标性成分，用于作用机制和质量标准的建立控制研究。为深入开展对经典名方涤痰汤的开发研究， 本研究选用方中具有较强生物活性，并作为药品质量控制指标性成分的辛弗林、 橙皮苷、新橙皮苷、α-细辛醚、β-细辛醚的总提取量为评价指标，优化涤痰汤提取工艺，为进一步开展古代经方中药复方制剂的制剂工艺和药效物质基础研究奠定基础。

响应面设计在优化中药制剂提取工艺方面广泛运用，能有效优化提取工艺条件，减少实验次数，提高效率。 支持向量机（support vector machine，SVM）是建立在统计学基础上的数学模型，特别适用于复杂的中小型数据集分类，能有效解决非线性及高维模式识别问题。 而最小二乘支持向量机（least squares-support vector machine，LS-SVM）由SVM改进而来[17]，将不等式约束变为等式约束， 使算法的复杂度大大减小[18]。本研究采用Box-Behnken响应面设计实验，以涤痰汤中5个成分的总提取量为指标， 联合LS-SVM数学模型，以期更有效地优化涤痰汤提取工艺。

1 材料和方法

1.1 仪器 Waters e2695高效液相色谱系统和Empower软件购于美国沃特世公司；FA2104型电子分析天平购于上海舜宇恒平科学仪器有限公司；JP-040超声波清洗机购于深圳洁盟清洗设备有限公司；Milli-Q Integral超纯水仪购于德国默克密理博公司；Matlab 2015b软件为美国迈斯沃克软件公司产品。

1.2 药物和试剂 姜半夏、麸枳实、茯苓、化橘红、石菖蒲、党参、竹茹均购于浙江中医药大学中药饮片有限公司（批号：200701、200801、200801、200901、200701、200901、200201），甘草、胆南星均购于浙江中医药大学杭州滨江门诊部（批号：20201028、20210401），均符合2020年版中国药典（一部）相应药材项下的质量标准要求；橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品均购于上海源叶生物科技有限公司（批号：Z31J6L2067、M03J8S39169）；辛弗林对照品、α-细辛醚对照品、β-细辛醚对照品均购于成都曼思特生物科技有限公司 （批号：MUST-19101716、MUST-20051401、MUST-19112611）； 甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）均购于美国天地有限公司（批号：21075219、21075218）；无水乙醇（分析纯）购于杭州双林化工试剂有限公司（批号：20210915）；磷酸（分析纯） 购于深圳西陇科学股份有限公司（批号：1708301）；水为超纯水。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱为SunFire C18柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，4%A；5～10 min，4%A→20%A；10 ～25 min，20%A →30%A；25 ～40 min，30%A →60%A；40～45 min，60%A→65%A）， 流速1 mL·min-1，进样量10 μL，柱温30 ℃，波长220 nm。

1.3.2 溶液制备

1.3.2.1 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，以甲醇定容至5 mL， 得到质量浓度分别为0.800、10.000、10.000、1.200、0.200 mg·mL-1的辛弗林、 橙皮苷、新橙皮苷、β-细辛醚、α-细辛醚储备液。精密量取上述储备液，混匀后加甲醇并定容至5 mL，制成质量浓度分别为0.096、1.200、1.200、0.144、0.024 mg·mL-1的混合对照品溶液。

1.3.2.2 供试品溶液制备 按涤痰汤处方比例称取50 g药材粉末，过40目筛，加10倍80%乙醇，55 ℃超声提取60 min，0.22 μm微孔滤膜过滤， 得到供试品溶液。

1.3.3 测定方法建立

1.3.3.1 系统适用性试验 分别吸取1.3.2.1和1.3.2.2项下的混合对照品溶液和供试品溶液适量，按1.3.1项下色谱条件分析。

1.3.3.2 线性关系考察 分别吸取1.3.2.1项下储备液，以甲醇梯度稀释制成辛弗林、橙皮苷、新橙皮苷、β-细辛醚、α-细辛醚5种成分系列梯度的对照品溶液， 然后按1.3.1项下色谱条件分析， 分别对峰面积（Y）和质量浓度（X）进行线性回归，得到回归方程。

1.3.3.3 精密度试验 取同一浓度的混合对照品溶液，按1.3.1项下色谱条件连续6次进样分析，记录5个主要成分的峰面积， 计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值。

1.3.3.4 重复性试验 取同一批样品6份，按1.3.2.2项下方法制备供试品溶液，按1.3.1项下色谱条件进样分析，记录5个主要成分的峰面积，计算RSD值。

1.3.3.5 稳定性试验 取样品适量， 按1.3.2.2项下方法制备供试品溶液，室温放置，分别于0、1、2、4、6、8、12 h进样分析，计算5个主要成分峰面积的RSD值。

1.3.3.6 加样回收试验 取已知含量的供试品6份，每份50 g，按1.3.2.2项下方法制备供试品溶液，加入含辛弗林、橙皮苷、新橙皮苷、β-细辛醚、α-细辛醚质量浓度分别为0.096、1.200、1.200、0.144、0.024 mg·mL-1的混合对照品溶液，分别进样分析，记录峰面积并计算5个主要成分的平均加样回收率及RSD值。

1.3.4 涤痰汤提取工艺的单因素实验 根据现代中药制剂工艺研究要求，制剂制备研究需要根据其药效物质合理有效制定其质量标准，有助于按照国家新药申报要求开展规范开发。 中药及其复方制剂在制备提取过程中溶剂浓度、液料比、提取时间、提取温度、提取次数、pH值等是影响制剂质量和药效的重要因素[19-20]。 其中，溶剂被认为是一个重要参数，它直接影响有效物质的溶解度。 结合药品安全性要求和现代制剂工艺制备规范要求，中药制剂常以水和不同浓度的乙醇作为溶剂，本研究根据涤痰汤中各指标成分的理化性质特点，根据相似相溶原理，采用乙醇作为提取溶剂，并结合文献[21-23]和预试验结果，选取乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度、提取次数等影响较大的几个因素，采用Box-Behnken响应面设计合理的水平，优化涤痰汤的制剂制备工艺。

按照涤痰汤处方比例分别精密称取每份样品50 g，过40目筛，固定其他因素不变，以单因素乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度、提取次数不同水平的实验条件下制备各供试品溶液，分别测定涤痰汤中5个主要成分的浓度，并计算提取量（mg·5g-1），考察各影响因素的不同水平对涤痰汤主要成分总提取量的影响。

1.3.5 Box-Behnken响应面设计优化涤痰汤提取工艺 以单因素试验为基础，同时考虑到提取次数对提取率的影响不大，本研究选取乙醇浓度（A）、液料比（B）、提取时间（C）、提取温度（D）为因素，通过Design-Expert软件进行Box-Behnken响应面设计。

1.3.6 LS-SVM优化涤痰汤提取工艺

1.3.6.1 模型的仿真及参数寻优 利用LS-SVM，以等式约束替代原来的不等式约束，在保证精度的前提下， 将复杂的非线性问题转化为对线性矩阵的求解[24]。 利用Matlab 2015b软件，以乙醇浓度（x1）、液料比（x2）、提取时间（x3）、提取温度（x4）为4个提取工艺数据，设涤痰汤中5种有效成分辛弗林、橙皮苷、新橙皮苷、β-细辛醚、α-细辛醚的总提取量为Y。考虑数据量，本研究采用形式简单、非线性逼近能力强的径向基核函数（radial basis function，RBF）[25]，同时确定核参数g和惩罚因子C，以使LS-SVM模型最优化。 两者与样本密切相关，C值代表了对误差的宽容度，C值越大，允许的误差越小，但C值过大会导致过拟合；C值越小则使模型泛化能力增加，同时对误差的容忍度也越大。核参数g则与样本的输入范围呈正相关，范围越大核参数g取值就越大，反之则相应减小。

1.3.6.2 条件寻优及结果预测 得到最优核参数和惩罚因子后，重新利用LS-SVM模型，得到主要成分总提取量预测值。 将实际值和预测值进行分析对比， 进一步验证预测结果的可信度。 最后根据Box-Behnken响应面实验结果结合制剂工艺实际，通过Matlab 2015b软件梯度增设待预测数据集， 利用LS-SVM模型进行最优条件的预测。

1.3.6.3 工艺验证 按照LS-SVM模型预测的最优条件进行5次平行试验，测定5种成分辛弗林、橙皮苷、新橙皮苷、α-细辛醚、β-细辛醚的总提取量平均值以及RSD值，并与预测值相比较，计算相对误差以验证其可靠性。

2 结果

2.1 系统适用性试验结果 将混合对照品溶液和供试品溶液进样后结果表明，供试品溶液色谱图中5种主要成分色谱峰的保留时间与混合对照品的保留时间相同，待测成分与其他色谱峰可实现基线分离，分离度＞1.5。 见图1。

图1 空白样品、混合对照品和涤痰汤的HPLC图Fig.1 HPLC diagram of blank sample， mixed reference and Ditan Decoction

2.2 线性关系考察结果 将辛弗林、橙皮苷、新橙皮苷、β-细辛醚、α-细辛醚5种成分系列梯度的对照品溶液进样分析，分别以质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性拟合，得到回归方程，说明5个对照品在相应浓度范围内线性关系良好。 见表1。

表1 回归方程和相关系数Tab.1 Regression equation and correlation coefficient

2.3 精密度试验结果 取同一浓度的混合对照品溶液， 连续6次进样，5个主要成分的峰面积RSD值分别为1.59%、0.48%、0.41%、0.71%和0.69%， 表明仪器精密度良好。

2.4 重复性试验结果 取同一批样品6份，制备供试品溶液后进样分析， 计算得到5个主要成分的峰面积RSD值分别为1.48%、0.70%、0.51%、0.81%和1.23%，表明方法重复性良好。

2.5 稳定性试验结果 制备供试品溶液，室温放置，分别于0、1、2、4、6、8、12 h进样分析， 结果5个主要成分峰面积RSD值分别为1.98%、1.53%、0.84%、1.34%和1.66%，表明制备的供试品溶液在12 h内较稳定。2.6 加样回收试验结果 取已知含量的供试品6份，制备供试品溶液，加入已知质量浓度的混合对照品溶液，记录峰面积，计算得到5个主要成分的平均加样回收率分别为97.53%、102.47%、99.72%、104.52%和98.09%，RSD值分别为1.79%、1.28%、1.64%、1.90%和1.58%，表明该方法准确性良好。

2.7 单因素实验结果

2.7.1 乙醇浓度对提取效果的影响 液料比为10:1（mL·g-1），提取温度为55 ℃，提取时间为60 min时，分别检测乙醇浓度35%、50%、65%、80%、95%对主要成分提取量的影响。见图2a。结果表明，乙醇浓度为50%时提取效果最好。

2.7.2 液料比对提取效果的影响 乙醇浓度为50%，提取温度为55 ℃，提取时间为60 min时，分别检测液料比6:1、8:1、10:1、12:1、14:1（mL·g-1）对主要成分提取量的影响。见图2b。结果表明，当液料比为10:1（mL·g-1）时，提取效果最好。

2.7.3 提取时间对提取效果的影响 乙醇浓度为50%，液料比为10:1（mL·g-1），提取温度为55 ℃时，分别检测提取时间为45、60、75、90、105 min对主要成分提取量的影响。见图2c。结果表明，提取时间为90 min时，提取效果最好。

2.7.4 提取温度对提取效果的影响 乙醇浓度为50%，液料比为10:1（mL·g-1），提取时间为90 min时，分别检测提取温度45、55、65、75、85 ℃对主要成分提取量的影响。见图2d。结果表明，提取温度为65 ℃时，提取效果最好。

2.7.5 提取次数对提取效果的影响 乙醇浓度为50%，液料比为10:1（mL·g-1），提取温度为65 ℃，提取时间为90 min时， 分别检测提取1、2、3、4次对主要成分提取量的影响。见图2e。结果表明，随着提取次数的增加，提取的主要成分的总含量增加，但当提取次数大于3次时，增势变缓。

图2 不同因变量对5种主要成分总提取量的影响Fig.2 Effects of different dependent variables on the total extraction volume of the five main components

2.8 Box-Behnken响应面设计结果 以单因素试验为基础，选取乙醇浓度（A）、液料比（B）、提取时间（C）、提取温度（D）为因素，进行Box-Behnken响应面设计，按照四因素三水平分别称取药材50 g，共运行试验30次，因素及水平和实验结果见表2、3。

表2 Box-Behnken实验设计的因素及水平Tab.2 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

2.9 LS-SVM优化涤痰汤提取工艺结果

2.9.1 模型的仿真及参数寻优结果 通过Box-Behnken响应面设计得到30组实验数据。 以30行4列的输入变量矩阵和30行1列的输出变量矩阵替代原本30行5列的数据矩阵，导入Matlab 2015b软件（因素水平值代替输入变量）。 为了更容易正确收敛得到最优解，对样本数据进行归一化处理，再用Matlab 2015b软件编程以及LS-SVM建模，同时采用RBF函数，最后采用交叉验证方法得到最优核参数g为2.5， 最优惩罚因子C为1.5。 见图3。

图3 最优参数结果图Fig.3 Result graph of optimal parameters

2.9.2 预测结果及分析 得到最优核参数和惩罚因子 后， 重 新 利 用LS-SVM 模 型， 可 以 得 到30 组Box-Behnken Design分析方案的主要成分总提取量预测值。 见表4。

表4 LS-SVM模型的指标成分总提取量预测值Tab.4 Predicted value of total extraction amount of index components of LS-SVM model （mg·5g-1）

利用均方误差 （mean-square error，MSE） 评估LS-SVM模型性能，公式如下：

表3 Box-Behnken实验设计及结果Tab.3 Box-Behnken experimental design and results

其中，n表示数据集组数，yi表示LS-SVM预测值，表示实际值。

最后将30组实际值和预测值代入上述公式计算得MSE=23.88，得到实验数据和模型预测数据分析对比图。见图4。表明30组实际和预测的总提取量都很接近，进一步表明模型仿真成功，拟合接近实际试验数据，预测效果可信。

图4 实验数据和模型预测数据分析对比图Fig.4 Comparison chart of experimental data and model prediction data analysis

2.9.3 模型的条件寻优及结果预测 根据Box-Behnken响应面实验结果结合制剂工艺实际， 通过Matlab 2015b软件梯度增设88组待预测数据集，利用LS-SVM模型进行最优条件的预测。 最终得到最优的提取条件是：乙醇浓度55%、液料比10:1（mL·g-1）、提取时间88 min、提取温度65 ℃，在此最优条件下预测指标成分总提取量为166 mg·5g-1。

2.9.4 涤痰汤最优提取条件的工艺验证结果 按照模型预测的最优提取工艺进行5次平行试验，测定5种成分辛弗林、橙皮苷、新橙皮苷、α-细辛醚、β-细辛醚的总提取量平均值为166.958 mg·5g-1（RSD值为0.28%）。见表5。 与预测值166 mg·5g-1比较， 相对误差为0.57%，说明实验值与预测值吻合度高，预测的涤痰汤最优提取工艺真实、可信。

表5 按照优化工艺进行的5次平行试验结果Tab.5 Results of 5 parallel tests carried out according to the optimized process （n=5， mg·5g-1）

3 讨论

古代经方作为中医处方的典型代表，是中医药传承的重要手段，也是中医学代代相传的历史瑰宝。 近年来，有关中药提取工艺的研究逐渐增多，但多以单味药为主。众所周知，中药中多组分配伍、多种有效成分的相互作用才是其发挥药效的根本，这使得中药成分研究与临床复方用药实际脱节，违背了中药研究的整体性思想[26]。 因此，探索复方的提取工艺优化十分有必要。新版的中药新药注册办法分四类进行注册申报，分别是中药创新药、中药改良型新药、古代经典名方中药复方制剂、同名同方药。 结合现代中药制剂工艺申报对质量标准建立的规范性要求，需要根据药效指标成分开展中药复方制剂工艺的全面研究。涤痰汤作为传统经方，现可考其源于温胆汤和导痰汤，方中半夏、竹茹、枳实、橘红燥湿降气化痰、清热除烦；胆南星善化风痰；石菖蒲具有豁痰开窍、醒神定志之效；茯苓、甘草补气渗湿，使湿无所聚，痰无所生，以固其本， 凡痰浊闭阻、 气机失畅所致的疾病均适用此方[1]。 经历代医学名家朱丹溪、汪昂、沈金鳌等的加减应用和演化，扩大了该方临床应用范围[27]，但其作用机制及药效物质基础还未深入研究，迫切需要基于中医整体思维明确其疗效物质，同时对其有效物质提取工艺进行优化。本研究引用了现代数学建模的思路方法，可用于涤痰汤以及其他经典名方中药复方制剂的开发研究，有助于建立制剂质量标准。

响应面设计是一种运用广泛的试验设计优化方法，大大减少试验次数，直接考察影响因素之间的交互作用[28]。 Box-Behnken响应面设计在中药提取方面的应用已较为普遍，能有效优化工艺条件，提高生产效益。 但响应面优化法也存在其局限性，当变量个数比较多以及模型存在很强的非线性时，寻找合适的优化设计会非常困难[29]。 所以在使用响应面设计之前，必须确定合理的影响因素与水平，设计的实验点应包括最佳实验条件，这就对前期数据提出较高要求。 本研究考察了乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度以及提取次数对有效成分总提取量的影响， 结果表明乙醇浓度、液料比、提取时间和提取温度对提取效果的影响更为显著，同时得到了因素的最优水平。以单因素实验为基础， 四因素三水平为实验点， 利用Box-Behnken响应面设计有效运行实验30次。

LS-SVM模型能将小数量样本、高维度等特征问题有效分类[30]，降低复杂度，增加求解速度，预测能力强、精度高，在回归估计、模式识别、控制理论以及非线性预测等方面运用广泛[31]。RBF函数具有良好的泛化能力和较快的学习收敛能力， 可将多维问题转化为一维问题[32]。 MSE被用来反映估计量与被估计量之间的差异程度，值越小，说明模型拟合的精确度越高。本研究在单因素实验和Box-Behnken响应面设计基础上，将实验结果联合LS-SVM模型，同时采用RBF函数， 分析预测涤痰汤的提取工艺。 结果提示MSE=23.88，表明拟合效果良好，进一步预测最优提取条件为：乙醇浓度55%、液料比10:1（mL·g-1）、提取时间88 min、 提取温度65 ℃，5种指标成分总提取量实验值与预测值相对误差为0.57%， 证明该模型真实、可信。

LS-SVM模型因其显著优势成为继神经网络之后的研究热点，但其在中药提取方面的运用还有待于进一步研究。 本研究通过Box-Behnken响应面设计联合LS-SVM模型预测，优化了涤痰汤的制剂提取工艺，经验证分析其具有较好的拟合预测效果。本研究结果为涤痰汤的开发奠定了较好的基础，有助于深入研究涤痰汤及其制剂的作用机制，同时也证实Box-Behnken响应面设计联合LS-SVM模型在优化中药复方制剂提取工艺上具有较好的有效性、实用性，为中药新药开发、制剂工艺研究提供了创新性方法。

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