外周血miR-200c水平对移植异基因造血干细胞后急性移植物抗宿主病发生的预测作用

武 坤，聂 波，李云涛，杨金荣，程沈菊，李艳红，史明霞*

(昆明医科大学第一附属医院 1.医学检验科; 2.血液科，云南 昆明 650032)

异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoi-etic stem cell transplantation，allo-HSCT)是利用供者持久而稳定的细胞移植体发挥抗疾病效应，移植成功后受者造血及免疫功能改善，处于嵌合状态时能够维系终身[1-2]。急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease，aGVHD)是allo-HSCT常见并发症，临床治疗虽有多种方案，但是效果欠佳，尽快找到评估aGVHD发生的因子对早期改善疾病具有重要帮助[3]。

随着生物分子靶向研究不断深入，微小RNA已经成为研究的热点。miR-200c基因簇定位于12号染色体p13.31，在多种肿瘤细胞中表达异常，例如在乳腺癌、恶性胶质瘤中水平下调，可调节肿瘤细胞生物学行为[4]。文献证实，肾移植大鼠体外实验研究表明被转化因子激活的长链非编码RNA(lncRNA-ATB)能够通过上调miR-200c表达而降低移植后急性排斥反应，其研究机制与抑制Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)信号通路相关[5]。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2014年1月至2018年10月在昆明医科大学第一附属医院血液科行allo-HSCT的51例患者作为研究对象，男性33例，女性18例，年龄10～47岁，中位年龄36岁。根据移植后是否发生aGVHD原则分为实验组(发生aGVHD)33例，对照组(未发生aGVHD)18例，所有患者或家属均知晓本文研究内容，自愿签署知情同意书[伦理号：(2021)伦审L条10号]。

1.2 方法

1.2.1 预处理方案：全相合移植患者采用改良白消安+环磷酰胺(BUCY)为预处理方案；采用环孢素+甲氨蝶呤预防aGVHD。半相合移植患者采用依托泊苷+白舒非+环磷酞胺+抗胸腺细胞球蛋白为预处理方案；采用环孢素+吗替麦考酚酯+甲氨蝶呤预防aGVHD。

1.2.2 aGVHD治疗方案：当患者发生aGVHD时，立即给予甲波尼龙1～2 mg/(kg·d)，同时将环孢素调整至初始剂量，给药5 d后观察疗效，无效者加用巴利昔单抗、他克莫司等二线治疗。

1.2.3 miR-200c引物的设计与合成：引物序列由上海生工设计并合成，目的基因：miR-200c引物上游:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′，下游:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；内参U6引物上游:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游:5′-AACG CTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.4 RT-qPCR 检测患者外周血中miR-200c相对表达：抽取患者肘部外周血5 mL置入加有抗凝剂的离心管中，离心力2 054×g、离心10 min，分离血清，-80 ℃低温保存。使用ReverTraAceqPCR RTKit返转录试剂盒定量检测RNA。反应体系为15 μL，5 μL RNA模板，3 μL miR特异型茎环引物及U6进行定量PCR扩增。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 min，60 ℃退火60 s，72 ℃ 45 s，循环40次，每个循环后收集1次荧光，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，连续检测荧光后进行产物分析。用2-ΔΔCt的方法计算相对表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较

两组患者均移植成功，且恢复造血功能，恢复时间为18 d，其中33例出现aGVHD，发生率为64.71%，两组性别、移植年龄分布、疾病类型、预处理方案、移植情况和供受者性别比较无差异(表1)。

2.2 RT-qPCR检测两组移植前后不同时间点miR-200c表达

实验组在移植前、移植后7、14、及72 d 时miR-200c表达均低于对照组(P<0.05)，在移植后28 d时两组无差异(表2)。

2.3 aGVHD发生前后miR-200c表达

对33例aGVHD发生后外周血中miR-200c为(2.23±0.25)显著低于发生前的(1.02±0.10)(P<0.001)。

表1 一般资料比较Table 1 Comparison of general data[n(%)]

表2 两组移植前后不同时间点miR-200c表达Table 2 Expression of miR-200c at different time points before and after transplantation in the two groups

2.4 不同aGVHD严重程度的miR-200c表达

与aGVHD Ⅰ度相比，Ⅱ度aGVHD患者外周血中miR-200c表达下调(P<0.001)，与Ⅱ度相比，aGVHD Ⅲ度患者外周血中miR-200c表达下调(P<0.001)(图1)。

*P<0.001 compared with aGVHD Ⅰ degree; #P<0.05 compared with aGVHD Ⅱ degree图1 不同aGVHD严重程度的miR-200c表达Fig 1 miR-200c expression in different aGVHD severity levels

2.5 miR-200c对aGVHD疾病的预测价值分析

移植28 d时，miR-200c ROC曲线下面积为0.850，敏感性为84.50%，特异型为81.2%，AUC=0.785，95%CI：0.669～0.837，Cutoff值为：0.93(P<0.05)(图2)。

图2 miR-200c对aGVHD的预测Fig 2 Prediction of aGVHD by miR-200c

2.6 生存分析

33例移植后28 d时发生aGVHD患者miR-200c水平为0.95±0.04，以均值(0.95)为基线，<0.95视为miR-200c低表达(19例)，≥0.95视为miR-200c高表达(14例)，对发生aGVHD所有患者随访2年，高表达组2年总生存率为71.43%(10例)，低表达组2年总生存率为50%(7例)，高表达组患者2年总生存率高于低表达组，组间比较存在差距(P<0.05)(图3)。

图3 两组患者2年生存率分析Fig 3 2-year survival rate analysis of patients in the two groups

3 讨论

aGVHD是allo-HSCT移植后100 d内发生的排斥反应，发生原因可能与移植患者进行强效预处理而导致消化道系统及皮肤黏膜排斥反应有关[6]。aGVHD发生的重要机制是供者移植物中T细胞对受试者主要及次要组织相容性抗原的差异识别发挥在抗原递呈现细胞内表达作用[7]。部分学者提出miR在供者T细胞攻击宿主过程中可能存在潜在的破坏靶细胞作用[8]。本文证实，aGVHD发病者外周血中miR-200c表达下调。miR-200c在肾移植动物体内表达下调，通过靶向调节其表达水平能够发挥抗急性排除作用，miR-200c能够通过下调TLR4信号改善免疫排除[9]。在器官移植患者中采用流式细胞仪检测TLR4表达，发现出现急性排斥患者TLR4表达上调，miR-200c 能够抑制移植者血清中炎性细胞因子表达，阻断核因子(NF-kB)活性减少急性排除时发生的炎性反应。

十八届欧洲血液学会上证实allo-HSCT移植后发生aGVHD疾病患者血液中多个miR出现表达异常，例如miR-146a等在其中呈现高表达，miR-3168呈现低表达[10]。本研究表明miR-200c在aGVHD发生后表达量低于未发生aGVHD疾病，推测miR-200c水平改变与移植者造血系统重建、供者T淋巴细胞攻击受者组织发生大量炎性反应诱导aGVHD发生有关。aGVHD患者当伴随机体感染时机体血清炎性因子表达上调，并随着aGVHD严重程度而升高，说明miR-200c具有通过调节炎性信号通过而降低免疫排斥，降低aGVHD疾病程度[11]。

对白血病及淋巴瘤患者进行allo-HSCT移植后患者发生aGVHD疾病，采用临床化学疗法治疗后复发率仍较高。对allo-HSCT移植后aGVHD患者5年生存率进行分析，高表达miR-155a GVHD患者生存率显著低于低表达者[12]。本文研究aGVHD复发率高于未患有aGVHD者，ROC曲线分析显示miR-200c诊断效能较强。miR-200c对肝癌患者临床敏感性及特异性较高，但也与miR-200c不同亚型、检测方法及样本量存在相关性。miR-200c在血液肿瘤及aGVHD疾病的诊断相关文献尚未报道，但对异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病有一定预测作用[13-14]。

综上所述：miR-200c水平降低与异基因造血干细胞移植后aGVHD的发生相关，随着aGVHD严重程度升高其表达水平降低，miR-200c低表达患者生存率较差，说明外周血中检测miR-200c可作为早期诊断和预测aGVHD的生物标志物。