高通量筛选NMNAT1抑制剂及其肿瘤杀伤作用

沙务嘎，李 隽

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系, 北京 100005)

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)是细胞内一种重要的辅助调节因子，它是多种氧化还原反应的辅酶，也是许多NAD+依赖酶的底物[1]。烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶1 (nicotinamide single nucleotide adenosine transferase 1, NMNAT1)是催化NAD+生物合成的关键酶，它将烟酰胺单核苷酸 (nicotinamide mononucleotide, NMN)转化生成NAD+，参与NAD+依赖的多种代谢过程，对维持生物体内NAD+水平的稳态十分重要。NMNAT1除参与NAD+生物合成外，还可以延缓神经元轴突变性，与神经退行性疾病密切相关[2]。NMNAT1介导的NAD+代谢在急性髓系白血病发生发展中也起着重要调控作用，影响癌细胞的增殖和相关代谢活动[3]；抑制NMNAT1使骨肉瘤细胞对放线菌素D的治疗更敏感，为骨肉瘤治疗提供了新思路[4]；肺肿瘤细胞系中NMNAT1的低表达水平与肿瘤对DNA损伤的敏感性增加相关，敲除NMNAT1可增强核糖体RNA转录并促进细胞死亡[5]。基于NMNAT1与肿瘤的密切关系，筛选以NMNAT1为靶点的抗肿瘤药物将具有重要意义。

本研究利用人重组质粒pET21b-NMNAT1在BL21 (DE3)大肠杆菌体系诱导表达人源NMNAT1蛋白，并鉴定了纯化的重组NMNAT1酶纯度，设计3步耦合酶联反应测定它的酶活性。在此基础上，对包含2 280种天然化合物的文库进行筛选，成功筛选出了6种高效的NMNAT1抑制剂，其中一种抑制剂Fraxetin能有效降低乳腺癌细胞的NAD+含量，促进乳腺癌细胞凋亡，揭示了NMNAT1抑制剂治疗肿瘤的潜在应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞: 人胚肾细胞系293T，人乳腺癌细胞系HCC70、MDA-MB-231[中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心(国家生物医学实验细胞资源库)]。

1.1.2 主要试剂：胎牛血清(Gibco公司)；DMEM培养基(Corning公司)；人NMNAT1 cDNA (OriGene公司)；pET21b质粒(Addgene公司)；限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ和T4 DNA连接酶(NEB公司)；BL21(DE3) 感受态细胞(天根生化科技有限公司)；Ni-NTA Beads(GE Healthcare公司)；天然化合物库(MCE公司)；Fraxetin(麦克林生化科技有限公司)；异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside，IPTG)、β-烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotina-mide adenine dinucleotide，NAD+)、乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)、Diaphorase、Resazurin(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 凝胶电泳检测NMNAT1蛋白表达：将pET21b-NMNAT1重组质粒转化入BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆菌落，加入含甘油的LB培养基保存于-80 ℃作为菌种，挑取菌种活化，IPTG诱导，凝胶电泳检测蛋白表达，具体步骤见参考文献[6]。

1.2.2 NMNAT1蛋白的纯化：将蛋白上清液用0.22 μm膜过滤，将Ni-NTA Beads装入填料柱，参照参考文献[7]纯化蛋白，收集各组分，进行蛋白电泳分析。

1.2.3 重组NMNAT1蛋白酶活力的测定：3段式酶联荧光法主要原理为第一步NMN在ATP存在下，由NMNAT1 转化生成NAD+，第二步由ADH将NAD+转化为NADH，第三步再通过Diaphorase传递NADH的电子使Resazurin转变为还原态，并发出荧光，设置不同浓度的NAD+标准品，可根据标准曲线，求得对应NAD+浓度，具体方法见参考文献[8]。

1.2.4 高通量筛选NMNAT1的抑制剂：取0.5 μL化合物加至96孔板中，终浓度为100 μmol/L，对照组不加入任何化合物，之后加入除NMNAT1重组酶以外的反应液45 μL，最后加入纯化的NMNAT1重组酶5 μL；37 ℃反应30 min后95 ℃ 15 s终止反应，按照1.2.3的步骤测定实验组与对照组的荧光强度。

1.2.5 细胞的基因敲低及加药处理：利用shRNA靶向敲低NMNAT1，构建293T对照细胞株和NMNAT1敲低细胞株(shNMNAT1)。将终浓度为50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L的Fraxetin添加至乳腺癌细胞培养液，24 h后收集细胞沉淀。

1.2.6 Western blot检测细胞内蛋白质表达水平：用 Triton 裂解液在冰上裂解细胞沉淀 30 min 后，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，收集上清液，蛋白定量后95 ℃变性5 min，SDS-PAGE电泳后转入硝化纤维素膜。膜用5%的脱脂牛奶封闭，然后孵育一抗，用TBST缓冲液清洗3次，孵育二抗，用TBST缓冲液清洗3次。最后将膜与ECL发光液孵育并进行曝光。

1.2.7 细胞内NAD+含量的测定：细胞用Triton裂解液处理，充分裂解，液氮冻融3次，置冰上30 min后4 ℃，12 000 r/min 离心10 min，取上清，测定蛋白浓度；取300 μL上清用10 ku超滤管过滤，4 ℃，8 000 r/min，离心30 min，取100 μL过滤出上清，加入1%的NaOH(1 mol/L)，60 ℃，30 min，去除所有NAD+，仅剩余NADH，再加入10% Tris-HCl(0.5 mol/L pH=6.8)中合pH;另取30 μL过滤出的上清，用PBS稀释4倍，作为NAD+和NADH的总和，减去NADH即为测得的NAD+，并除以蛋白浓度得到细胞内NAD+含量。

1.2.8 转录组测序：将对照组及敲低NMNAT1的293T细胞，用无RNase的DPBS清洗后，加入1 mL Trizol试剂，提取RNA。将提取的RNA送至北京诺禾致源生物技术有限公司进行转录组测序(RNA-sequencing, RNA-seq)，得到基因表达谱数据。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 NMNAT1 蛋白的诱导表达和纯化

可检测到在相对分子质量约32 ku处有目的蛋白表达(图1A)，且纯度较高(图1B)。

2.2 NMNAT1 蛋白的酶活力测定

检测NMNAT1重组蛋白酶活性的原理如图1C所示。由米氏方程测得重组NMNAT1酶的Vmax为1.034 μmol/(L·min)，米氏常数为11.91 μmol/L(图1D)，检测到的荧光信号与NAD+浓度成正比关系(图1D)。

2.3 NMNAT1抑制剂的筛选

使用购自MCE公司的天然化合物库(Cat.No.: HY-L021)搭建了高效酶联反应筛选平台，鉴定这些化合物对NMNAT1活性的影响(图2A)，筛选得出其中共有37种化合物表现出对NMNAT1活性的抑制作用(抑制效率>90%)，这其中又以6种化合物的抑制作用最为强烈(抑制效率>99%)，改变抑制剂的浓度，得到6种化合物的抑制曲线(图2B)，并计算其IC50(表1)。

A.over expression of NMNAT1 in E.coli; B.purification of NMNAT1 using Ni-NTA; C.schematic diagram of NMNAT1 activity essay; D.verification of NMNAT1 activity essay: kinetic curve of NMNAT1 activity assay (left) and standard curve of NAD+(right)

A.screening results of natural compounds library; B.concentration response curve of 6 potent inhibitors candidates on NMNAT1 activity

表1 6种强效抑制剂的结构与IC50Table 1 The structures and IC50 of 6 potent inhibitors candidates

2.4 敲低NMNAT1后差异基因的表达

为了确定抑制NMNAT1对细胞基本功能的影响，利用shRNA敲低293T细胞NMNAT1(图3A)，对其进行RNA-seq分析，筛选出shcont和shNMNAT1两组之间的差异表达基因(图3B)，其中表达上调的基因有741个，表达下调的基因有643个。对差异表达基因进行GO分析，上调的基因主要富集在p53类介导的DNA损伤内在凋亡信号通路、DNA修复、组蛋白甲基化以及miRNA介导的翻译抑制通路(图3C)；下调的基因主要富集在细胞增殖、线粒体电子传递(NADH到泛醌)以及MAPK级联反应等通路，其中电子从NADH到泛醌的传递减少，会直接造成线粒体呼吸链下游NAD+的减少(图3D)。6种NMNAT1候选抑制剂中，fraxetin(7,8-二羟基-6-甲氧基-2-苯并吡喃酮)又名白蜡树内酯、秦皮素，已被证明具有促凋亡的作用[9]，与转录组结果分析方向一致，因此被选作NMNAT1抑制剂候选化合物进行后续实验。

2.5 Fraxetin降低乳腺癌细胞NAD+含量并促进细胞凋亡

选取乳腺癌细胞研究fraxetin对肿瘤的杀伤机制，结果显示fraxetin降低了乳腺癌细胞NAD+含量(图4A)，Western blot结果显示fraxetin促进了乳腺癌细胞凋亡，具体表现在凋亡标志物p53增多，抗凋亡因子Bcl-2减少(图4B～C)。

A.NMNAT1- knockdown in 293T cells; B.volcano plots; GO enrichment analysis of up (C) and down (D) regulated differentially expressed genes after NMNAT1 knock-down

A.fraxetin reduced NAD+ level of HCC70 cells (left) and MDA-MB-231 cells (right) after treatment for 24 hours; fraxetin increased protein level of p53 while reduced Bcl-2 proteins in HCC70 cells (B)and MDA-MB-231 cells (C); *P<0.05 compared with control group

3 讨论

NAD+是生物体进行基本生物过程所必需的物质，对于增殖和代谢活跃的肿瘤细胞，需要更多的NAD+来维持生命活动，因此选择性降低NAD+水平可以作为肿瘤治疗的一种策略[10]。鉴于NMNAT1在NAD+生物合成中的重要作用，其在这一策略中将是重点研究目标。NMNAT1的核心结构为典型的二核苷酸结合域，其抑制剂可以占据催化结构域内的底物结合位点，起到抑制酶活性的作用[11]。单宁酸 (gallotannin) 是目前已报道的强效NMNAT1抑制剂，由1分子的葡萄糖与8～9个没食子酸结合而成，含有大量苯酚羟基，能以疏水键和多点氢键与蛋白质反应，继而影响蛋白活性，筛选出的NMNAT1抑制剂也都含有酚羟基，这可能是其发挥抑制作用的潜在机制；富含单宁酸的五倍子提取物可以抑制MAPK、NF-κB和PI3K/AKT信号通路，从而诱导肺癌细胞凋亡、细胞周期停滞[12]，然而单宁酸的脂溶性差、生物利用度低、半衰期短，使它的临床应用受到限制[13]。Fraxetin是从白蜡树皮中提取出的天然化合物，可以作为中药使用，安全副作用低，具有抗肿瘤、抗氧化和抗感染作用[9, 14]；已有研究表明其以剂量依赖性方式抑制MCF-7细胞的增殖，还诱导MCF-7细胞形态收缩和染色质异常凝集，显露了fraxetin对乳腺癌的潜在治疗作用[15]。此次筛选发现它是NMNAT1的抑制剂，能降低乳腺癌细胞的NAD+含量，诱导癌细胞凋亡。本项研究的结果显示fraxetin有望成为治疗乳腺癌的新作用靶点。

综上所述，本研究建立了一种基于酶联反应检测NMNAT1酶活力的平台，并成功筛选出了6种潜在的NMNAT1抑制剂，其中fraxetin作为NMNAT1强效抑制剂，能降低乳腺癌细胞NAD+含量并促进细胞凋亡；同时转录组测序分析揭示了敲低NMNAT1造成细胞凋亡通路上调，细胞增殖通路下调，提示抑制NMNAT1可能通过促进细胞凋亡抑制癌细胞的增殖，为NMNAT1抑制剂在肿瘤治疗领域的应用提供了理论支持。