多孔隙三维环境下细胞接种密度对血管平滑肌细胞增殖行为的影响△

刘 江，冯子倍，周嘉辉，吴岳恒，，林展翼

［1.华南理工大学医学院，广州 510006；2.广东省人民医院（广东省医学科学院），广州 510080；3.先进制造科学与技术广东省实验室（季华实验室），广东佛山528200］

血管平滑肌细胞是组织工程血管构建最常用的种子细胞，足够量的细胞可以带来足够量的细胞外基质，因此，合适的接种密度是非常关键的成功因素之一［1］。适宜的细胞密度可以促进细胞间接触的建立，维持合适的细胞表型［2］。既往贴壁细胞培养的研究发现，过高的平滑肌细胞接种密度很快因细胞接触抑制机制导致增殖停滞，而过低的接种细胞密度可以因培养过程中细胞间接触的减少，导致信号转导减弱及分泌细胞因子减少，不利于细胞增殖［3］。体外基于生物反应器进行的组织工程血管构建，需要使用多孔隙支架材料形成一定厚度的管状结构，将细胞黏附在三维空间环境下进行长时间的培养［4］。这种三维空间培养环境与既往体外二维培养环境有明显差别，合适的细胞接种密度在很大程度上将取决于种子细胞类型和支架材料特性等因素，培养过程中的细胞行为也将明显不同于既往的二维培养的细胞［5］。本研究拟将采取3 种不同细胞的浓度在聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）支架材料上进行培养，观察血管平滑肌细胞的形态变化、黏附情况、增殖速度和表型改变等影响，从而探究合适的密度区间，为后续的小口径组织工程血管研究提供指导意见。

1 材料和方法

1.1 支架材料的处理和细胞接种

取人主动脉中层细胞，用贴块法培养人血管平滑肌原代细胞，待细胞爬出后再进行传代培养。培养基为含有F12k 基础培养基、20% 胎牛血清（Corning）、100 U/mL 青霉素和链霉素（Gibco）。细胞在37 ℃和5% 二氧化碳中生长，细胞融合时传代，使用3～6 代内细胞。将PGA 支架在1 mol/L 氢氧化钠溶液中浸泡1 min，并用无菌水洗涤两次，75%酒精中浸泡2 h，然后在超净工作台上通风1 h干燥。将PGA支架置于24孔板中，并把不同浓度的细胞悬液（1×105个/mL、1×106个/mL、1×107个/mL）接种到PGA 支架上。接下来，将孔板倒置4 h 使细胞黏附到PGA 支架上。然后，将含有细胞的支架置于6 孔板中进行后续培养。

1.2 扫描电镜方法

将样品在2.5%戊二醛溶液中固定10 min，用蒸馏水冲洗5 min，然后在70%、85%、95% 和无水乙醇中分别脱水5 min。然后将样品在六甲基二硅氮烷中浸泡10 min 并风干3 h。将干燥的样品镀金，并用扫描电子显微镜（Merlin Carl Zeiss Jena）观察。

1.3 免疫荧光方法

将样品浸入4%多聚甲醛中，然后用0.2%Triton×-100 透化5 min。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3 次后，在室温下用鬼笔环肽（Proteintech）处理样品20 min，然后用4′，6-二脒基-2 苯基吲哚（DAPI）（Thermo Fisher Scientific）封片。最后，使用荧光共聚焦激光扫描显微镜观察细胞。

1.4 细胞活力测定方法

使用Cell Counting kit-8（CCK8）试剂盒测定来确定细胞的活力。将PGA 剪成0.25 cm× 0.25 cm的正方形，放入96 孔板中。材料处理后，将不同浓度的细胞悬液接种在支架上，然后将96 孔板倒置4 h 后，加入培养基培养4 d。培养4 d 后，弃去培养基，每孔加入100 μL 到含有10%CCK-8 试剂的培养基。反应2 h 后，将培养基转移到另一96 孔板中，使用酶标仪在450 nm 处测量每个孔的吸光度值。

1.5 免疫印迹方法

从样品中提取总蛋白，并通过电泳，转膜，将目的蛋白转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，随后用5% 牛奶封闭液进行封闭。一抗增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）（CST，1∶1 000），α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）（Proteintech，1∶1 000）、Calponin（Proteintech，1∶1 000）和3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（Proteintech，1∶10 000）分别与PVDF 膜在4 ℃下孵育过夜。然后在4 ℃下与二抗一起孵育2 h。我们使用增强型化学发光试剂检测条带，使用ImageQuant LAS 500 进行可视化。使用Image J 软件计算每个蛋白质条带的强度，使用GAPDH 作为标准化参考。

2 结果

2.1 聚乙醇酸支架材料上不同接种浓度的血管平滑肌细胞形态变化

PGA 支架材料为多孔结构，可以营造出三维结构（图1）。将不同浓度的细胞接种在PGA 支架上，细胞的形态是不同的，细胞形态会根据支架形状而发生变化。当细胞悬液浓度为1×105个/mL时，接种后支架上的细胞大多数以单个球型存在，散落分布在支架各处，接种后可见有较多细胞从支架上掉落。当细胞悬液浓度为1×106个/mL 时，支架上的细胞可以沿着支架爬行并伸展开来，成簇存在，接种后可见有较少的细胞从支架上掉落。当细胞悬液浓度为1×107个/mL，细胞布满整个支架孔隙中并将PGA 支架包裹起来，形成片层结构，几乎没有细胞掉落（图2）。

图1 PGA 支架材料［A：PGA 支架材料的大体图（标尺：200 mm）；B：PGA 支架材料的扫描电镜图（标尺：50 μm］

图2 在支架材料上不同接种浓度的细胞形态变化及接种后细胞掉落情况［A、D、G：不同浓度的细胞悬液接种在支架上的扫描电镜图（标尺：20 μm）；B、E、H：不同浓度的细胞悬液接种在支架上的免疫荧光图，红色为肌动蛋白，蓝色为细胞核（标尺：20 μm）；C、F、I：不同浓度的细胞悬液接种在支架上掉落在底部的细胞（标尺：200 μm）］

2.2 聚乙醇酸支架材料上不同接种浓度的平滑肌细胞增殖速度和表型改变

从CCK8 的结果（图3A）可以看出，当细胞接种浓度为1×105个/mL 时，细胞一直处于增殖状态，增殖速度较为平稳；当细胞接种浓度为1×107个/mL时，前3 d 的增殖速度较快，但到了第5 天时，增殖速度放缓；当细胞接种浓度为1×106个/mL 时，细胞增殖速度最快，并在第5 天时，细胞总数超过了接种浓度为1×107个/mL 的组别。

PCNA 也是反映细胞增殖状态的指标，Western blot 检测培养了4 d 的细胞也得到了相同的结果，其中细胞接种浓度为1×106个/mL 时，PCNA 的表达最多（图3B）。与二维培养（control）的结果相比较，支架环境下血管平滑肌细胞收缩表型标志物α-SMA 和Calponin 的表达较低，但不同接种浓度的细胞表型没有明显差异。

图3 PGA 支架材料上不同接种浓度的平滑肌细胞增殖速度和表型变化［A：CCK-8 法检测不同浓度的细胞在PGA 支架材料上的增殖速度；B：Western blot 检测不同浓度的细胞在PGA 支架材料上的增殖和表型标志物］

3 讨论

小口径组织工程血管移植物是未来自体血管移植最有希望的替代品之一，为全球组织工程界和血管外科学界研究的热点难点，现已有了突破性进展［6］。作为组织工程血管培养三要素之一，支架材料模拟体内血管中细胞外基质黏附支撑作用，让种子细胞沿着支架爬行生长［7］。与常用的培养皿等二维贴壁生长环境不同，支架材料形成的三维空间结构为细胞创造出更多的生长空间，从而带来细胞行为上的变化［8］。细胞接种作为细胞在多孔支架内分布和附着的第一步，对随后的细胞增殖和细胞外基质分泌至关重要。一个成功的初始条件，即合适密度的种子细胞，有助于细胞在整个支架上快速增殖和均匀分布，并有利于组织工程血管的形成。本研究结果发现，3 组不同细胞密度的组别中，细胞密度较大组（1×107个/mL）从支架上掉落的细胞比例最少，但培养后期出现增殖抑制现象；细胞密度较小组（1×105个/mL）细胞可以长时间处于增殖状态，但从支架上掉落的细胞较多；当细胞密度介于二者之间（1×106个/mL）时，细胞一直处于增殖状态，并在第5 天时细胞的总数可以超过了密度最大的组，接种后细胞掉落的数目也较少。

三维空间环境中，细胞形态不仅受到支架材料的影响，也受到细胞密度的影响。此外，细胞密度会影响细胞悬液的黏度，细胞数量越多其悬液黏度就会越高，接种于PGA 支架后细胞就不易掉落［9］。而较低的接种密度会减少培养中肌源性细胞之间的细胞-细胞接触发生率，导致这些细胞的融合水平降低［10］。但当细胞密度过高会造成空间拥挤导致接触抑制，致密的组织会影响氧气和养分的输入。有研究表明，高密度的细胞能够产生更多生理相关的模型组织，但高密度对培养细胞完全成熟的能力有负面影响［11］。故应综合考虑细胞掉落情况（细胞接种效率）和接种密度对组织正常生长的影响来做出选择。

血管平滑肌细胞的增殖往往伴随着细胞外基质的分泌，在组织工程血管培养的初期，细胞快速增殖不仅能使细胞迅速布满支架材料，而且能够促进血管平滑肌细胞分泌细胞外基质来包裹支架和填充支架孔隙，从而形成致密的细胞层［12］。本研究中不同细胞培养密度的增殖率差异，主要通过CCK-8 和殖抗细胞核增原PCNA 分子水平差异来显示。结果显示，细胞培养密度影响血管平滑肌细胞的增殖情况，这促使我们对细胞接种密度进行优化选择。

综上所述，根据细胞增殖和细胞掉落情况，我们认为1×106个/mL 到1×107个/mL 这样一个血管平滑肌细胞接种密度区间，将有利于细胞在PGA支架材料所形成的多孔隙三维环境下生长和细胞外基质分泌。同时，本研究将有助于我们进一步了解支架材料对细胞影响，为组织工程血管培养的改进提供参考依据。