脓毒症患儿血浆miR-455-5p和miR-483-5p检测的临床应用

邓颖云，邱成英，吴日暖，匡晓玲，卢 磊（三亚市人民医院儿科，海南三亚572000）

儿童脓毒症(sepsis)是一种重度感染性疾病，可导致身体各个器官功能衰竭，其病情凶险，病死率较高，是导致儿童死亡的主要原因之一[1]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）作为一类新型的基因调控分子，参与全身炎症反应过程，对脓毒症诊断及预后判断具有较大的意义[2-3]。有报道指出，miR-455-5p及miR-483-5p在脓毒症中异常表达，参与脓毒症的发生发展，并可能是脓毒症的潜在分子标志物[4-5]。降钙素原（procalcitonin，PCT）是一种反映炎症反应程度的有效指标，可用于评价脓毒症患者的严重程度、病情转归及疗效监测[6]。目前，关于miR-455-5p及miR-483-5p在脓毒症中的临床应用价值尚未有报道，其能否作为脓毒症诊断及预后评估的标志物尚未清楚。为此，本研究检测脓毒症患者血浆miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平，分析其对儿童脓毒症诊断及预后评估的价值，为儿童脓毒症的诊疗提供指导。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2019年1月～2020年12月三亚市人民医院收治的108例脓毒症患儿，其中男性66例，女性42例，年龄10个月～14（5.10±1.73）岁。纳入标准：①年龄≤14岁，住院时间＞48 h；②符合儿童脓毒性休克(感染性休克)诊治专家共识(2015版)中的诊断标准[7]。排除标准：①存在自身免疫疾病、血液病及恶性肿瘤者；②临床资料不完整者及放弃治疗者。根据脓毒症患儿病情进展情况，分为脓毒症非休克组（65例）和脓毒症休克组（43例）；根据脓毒症患儿28天的生存情况，分为存活组（74例）和死亡组（34例）。同期收集50例健康儿童作为对照组，其中男性28例，女性22例；年龄1～14岁（5.24±1.65）岁。各组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经伦理委员会批准，患者知情同意。

1.2 仪器与试剂 7500型荧光定量PCR仪，PCR相关试剂盒和Trizol试剂盒由上海生工生物工程公司提供。CL-2200i迈瑞全自动化学发光免疫分析仪及配套试剂。

1.3 方法

1.3.1 miR-455-5p及miR-483-5p检测：采集3 ml肘静脉血于EDTA抗凝管中，离心分离血浆。以 U6为内参，使用荧光定量PCR仪检测miR-455-5p及miR-483-5p水平。反应体系为20μl：10μl TaqMan通用混合物溶液（2×），1μl 引物及探针Mix（20×），1.33 μl反向转录脱氧核糖核酸，7.67μl双蒸馏水。扩增条件为：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，55℃～60℃退火及延伸30 s，共40个循环。

1.3.2 PCT检测：另采集研究对象静脉血2 ml，使用化学发光免疫分析仪及配套试剂检测PCT水平，参考范围：0～0.05 μg/L。

1.4 统计学分析 采用SPSS20.0软件分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用SNK-q检验。应用受试者工作特征（ROC）曲线分析血浆miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平对脓毒症诊断及预后评估的价值，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脓毒症休克组和非休克组血浆miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平比较 见表1。与对照组比较，脓毒症休克组和非休克组血浆miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平明显升高（t=16.517，15.280，14.506，13.387，24.638，20.517，均P＜0.01），且脓毒症休克组明显高于非休克组（t=13.602，12.985，15.173，均P＜0.01）。

表1 脓毒症休克组和非休克组血浆miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平比较（±s）

表1 脓毒症休克组和非休克组血浆miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平比较（±s）

项目 对照组（n=50） 脓毒症非休克组（n=65） 脓毒症休克组（n=43） F值 P值miR-455-5p (2-△△Ct) 0.78±0.24 1.95±0.81 4.06±1.35 13.958 ＜0.01 miR-483-5p (2-△△Ct) 0.35±0.10 1.38±0.57 3.40±1.13 12.773 ＜0.01 PCT（μg/L） 0.02±0.01 5.73±2.36 19.97±9.12 16.170 ＜0.01

2.2 死亡组和存活组血浆miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平比较 见表2。与对照组比较，死亡组和存活组血浆miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平明显升高（t=13.924，12.467，12.173，11.506，21.719，18.825，均P＜0.01），且死亡组血浆miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平均明显高于存活组（t=12.162，10.513，13.874，，均P＜0.01）。

表2 死亡组和存活组血浆miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平比较（±s）

表2 死亡组和存活组血浆miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平比较（±s）

项目 对照组（n=50） 存活组（n=74） 死亡组（n=34） F值 P值miR-455-5p (2-△△Ct) 0.78±0.24 1.74±0.68 4.30±1.52 15.718 ＜0.01 miR-483-5p (2-△△Ct) 0.35±0.10 1.20±0.45 3.61±1.24 13.904 ＜0.01 PCT（μg/L） 0.02±0.01 4.36±1.94 21.35±9.58 18.226 ＜0.01

2.3 血浆miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平诊断脓毒症的价值 见表3。血浆miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平诊断脓毒症的最佳截断值分别为2.14，1.65，2.87μg/L，三项联合诊断脓毒症的曲线下面积（AUC）为0.904（95%CI：0.846～0.967），明显高于单项miR-455-5p，miR-483-5p及PCT，差异有统计学意义（均P＜0.05），其敏感度和特异度分别为92.4%和83.7%。

表3 血浆miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平诊断脓毒症的价值

2.4 血浆miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平 预测脓毒症患儿死亡的价值 见表4。血浆miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平预测脓毒症患儿死亡的最佳截断值分别为2.92，2.35，14.16μg/L，三项联合预测脓毒症患儿死亡的AUC（0.928，95%CI：0.870～0.984）明显高于单项miR-455-5p，miR-483-5p及PCT，差异有统计学意义（均P＜0.05），其敏感度和特异度分别为94.7%和86.5%。

表4 血浆miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平预测脓毒症患儿死亡的价值

3 讨论

儿童脓毒症是由于宿主对感染的过度炎症反应而引起的一种严重综合征，尽管最近的治疗取得了进展，但死亡率仍然很高。脓毒症的非特异性临床特征和延迟诊断一直是人们关注的问题，目前尚无决定性的诊断或预后生物标志物。由于miRNA具有高度的敏感度和准确度，因此它被广泛应用于治疗学等个性化医学领域。越来越多的研究表明，脓毒症患者外周血中miRNA表达水平可在一定程度上反映机体炎症情况，同时还可判定疾病严重程度，有望成为脓毒症早期诊断及预后评估的生物学指标[8]。近年来研究发现，miR-455-5p和miR-483-5p作为小分子RNA家族中的成员，可以参与调节炎症反应的通路，影响炎性因子的产生，在调控严重炎症反应中发挥了重要的作用[9-10]。PCT是降钙素的前肽物质，是鉴别细菌感染和病毒感染的良好指标，在严重细菌感染和脓毒症中显著升高，对脓毒症的早期诊断和指导临床抗生素使用具有较大帮助[11-12]。

本研究显示，脓毒症休克组血浆miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平明显高于脓毒症非休克组，而且死亡组明显高于存活组，说明血浆miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平升高与脓毒症患儿的病情严重程度密切相关。分析其原因可能是死亡患儿的全身炎症反应比较严重，引起大量炎症因子释放，病情无法得到有效控制，miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平显著升高；而存活患儿病情比较稳定，炎症反应程度降低，miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平呈下降趋势。因此，血浆miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平呈明显升高的脓毒症患儿，病情较为严重，临床上应及时采取有效的治疗措施，以最大限度地减少脓毒症患儿的死亡情况。叶荣宗等[13]研究认为，miRNA异常表达与脓毒症患者病情严重程度及预后有关，在脓毒症发病机制、诊断和靶向治疗中发挥较大的作用。ZHAO等[14]研究发现，脓毒症患者miRNA表达水平明显升高，而且与疾病严重程度、器官功能损害及病死率明显相关，可以作为评估脓毒症患者病情严重程度和预后的一个有用的生物学指标。另有研究表明，血浆PCT水平在不同严重程度脓毒症患儿中存在明显差异，儿童脓毒症的显著发病率和死亡率有关，PCT水平检测可用于儿童脓毒症的早期识别，风险分层、预测和/或抗生素决策指导[11]。

本研究ROC曲线显示，miR-455-5p和miR-483-5p联合PCT对脓毒症诊断及预测死亡的曲线下面积最大，其敏感度和特异度较好。提示miR-455-5p和miR-483-5p对儿童脓毒症诊断及预后评估具有一定的价值，联合PCT检测可弥补单项检测的不足，并有助于提高脓毒症诊断及预后评估的价值。KARAM等[15]研究认为，miRNA表达水平与脓毒症患儿的病情严重程度及预后相关，对预测脓毒症患儿的预后具有较好的临床价值。RAHMEL等[16]研究表明，miRNA表达水平升高与脓毒症患者病情严重和预后不良相关，是判断脓毒症严重程度及预后的生物学指标，可能为脓毒症基因水平治疗提供新的思路。既往的研究也证实，PCT作为一种新的炎症指标，对脓毒症的诊断和指导治疗方案等方面具有很高的应用价值，是目前诊断脓毒症最有效、最可靠的常用标志物[17]。

综上所述，血浆miR-455-5p和miR-483-5p表达水平在脓毒症患儿中明显升高，其高表达与脓毒症患儿的病情严重程度及死亡相关，联合PCT检测有助于提高儿童脓毒症的诊断及预后评估价值，同时也为脓毒症患儿的靶向治疗提供新的思路。PCT作为脓毒症诊断的特异性指标已得到临床广泛推广，但miR-455-5p和miR-483-5p在脓毒症中的应用处于初步探索阶段，仍需要更多的临床前瞻性研究进一步验证，为脓毒症的诊断带来更多的可靠标志物。