大豆肽补充量和运动时间对大鼠血清游离氨基酸水平的影响

谭秋实 邵晶 周丽丽 高红 许葆华 付劲德 王启荣 方子龙 伊木清

国家体育运动医学研究所运动营养研究中心，国家运动营养测试研究中心，国家体育总局运动营养重点实验室（北京 100061）

机体蛋白质合成与分解处于动态调控中，血液游离氨基酸（free amino acid，FAA）水平反映了蛋白质（肽和氨基酸）的消化吸收与组织需求平衡的动态变化。运动时，蛋白质合成减少、分解增加，进入血液的FAA随血液输送到组织，通过与糖代谢及三羧酸循环中的中间产物相互转化而参与氧化供能，可达总能耗的2%~6%[1]。氨基酸氧化供能比例受运动强度、时间和其他能源物质水平的影响，肌糖原耗竭时，氨基酸供能可提升至10%~15%，大强度、长时间运动后血液FAA水平下降。外源性蛋白质/肽/氨基酸补充增加FAA水平，以加强能量供给、延缓运动疲劳、改善运动能力、促进骨骼肌重建及组织细胞损伤修复，是主要的营养学措施之一[2]。

补充蛋白质和碳水化合物（糖）可增强运动训练适应能力[3]、热调节能力[4]、重复冲刺跑[5]、力量[6]、急性或重复性耐力运动能力或增加力竭运动时间等[7，8]，可改善运动后肌肉蛋白质和糖原合成代谢[9-12]，减轻肌肉损伤[13，14]。有研究证明，糖与蛋白质之比为3~4︰1（相当于肽/糖比0.25~0.33）时效果更好[10，15]。然而，不同运动时间的运动中补充不同肽含量或肽/糖比饮料对血清FAA水平的影响，什么样的肽补充量能有效维持或增加运动中血液FAA水平，以保证运动时有充足的氨基酸供给，目前尚不清楚。

补充小剂量水解乳清蛋白即可有效增加骨骼肌中亮氨酸（leucine，Leu）的浓度[16]；胶原肽补充结合抗阻训练可增加骨骼肌收缩蛋白合成代谢[17]；补充胶原肽可改善运动后肌肉恢复[18]；大豆发酵提取物可改善自行车计时冲刺能力[19]；蚕丝肽可改善小鼠运动能力[20]。Tipton等是较早开展补充氨基酸对肌肉蛋白合成影响研究的学者[21]，后续也有研究证明：只要在运动前、中、后（即刻）快速增加血液氨基酸水平，均可以增强对抗阻训练的适应[22]。

蛋白质中必需氨基酸（essential amino acid，EAA）及Leu含量是肌肉蛋白质合成反应的决定因子[23]。大豆蛋白的EAA和Leu含量不如乳清蛋白高，但在植物蛋白中，其更接近人体氨基酸组成。经特殊酶解而成的大豆肽的EAA含量较高，也更易于吸收，已被较广泛应用于食品饮料产品中。

本研究采用大豆肽（多为含2~8个氨基酸分子的寡肽，支链氨基酸含量近16%，EAA含量大于35%）为蛋白质源，以不同剂量加入到含5%蔗糖饮料（CHO）和适量电解质及维生素的运动饮料中，形成不同肽含量或肽/糖比的灌胃液，观察大鼠在一次性1.5 h和3.0 h游泳耐力运动中定时定量灌胃后血清FAA浓度的变化，旨在分析不同肽补充量和不同运动时间的影响及其可能意义。

1 对象与方法

1.1 动物与分组

110只160～180 g Wistar大鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司）于清洁级动物房[许可证号：SYXK（京）2006-0017]常规饲养，自由进水（市售饮用水）、采食（普通大鼠饲料），光照12小时，适应1周后（平均体重300.0±9.8 g）被随机分为11组，每组10只，包括安静对照组（SC组）1组、运动对照组（EC组）2组、运动补液组（ES组）8组。SC组和EC组以含5%CHO的饮料（含电解质和维生素）灌胃，ES组分别以不同肽含量的肽-糖饮料（peptide-CHO，P-CHO）灌胃。EC组2组大鼠分别运动1.5 h和3.0 h；ES组8组中，4组大鼠运动1.5 h，4组大鼠运动3.0 h（表1）。大鼠实验前一天下午6点撤食，不禁饮水。

表1 大鼠分组及干预方式

1.2 方法

1.2.1 饮料配制

据GB 15266-2009运动饮料[24]要求，运动饮料中可溶性固形物含量为3%～8%，本研究以5%的CHO饮料为基础，逐渐添加大豆低聚肽粉，配成肽浓度分别为1.43%、2.87%、5.73%、11.47%的P-CHO饮料，其肽/糖浓度比分别为0.0、0.3、0.6、1.2和2.4（表1）。大豆肽粉原料的氨基酸含量见表2。

表2 大豆肽粉氨基酸含量百分比

1.2.2 游泳运动方案、饮料灌胃

游泳在水泵驱动的流动水游泳池中进行，游泳池大小1.2 m（长）0.6 m（宽）0.8 m（高），水流量4 m3/h，水温25℃±2℃。实验分10天进行，每天分别从安静组、运动组10个亚组中各挑出1只进行当天的实验，安静组1只不运动，运动组10只中5只游泳1.5 h、5只游泳3.0 h。各组分别选择CHO饮料和不同肽含量PCHO饮料灌胃。放入游泳池前10~15分钟，每只大鼠灌胃0.6 ml（首次加倍）。游泳运动开始后，每隔15分钟，灌胃0.3 ml饮料，运动1.5 h和3.0 h的大鼠分别共灌胃6次和12次。

1.2.3 肽补充量和亮氨酸补充量

运动中补充几种肽含量饮料，单位时间肽补充（单位时间肽补充量=饮料肽浓度×单位时间灌胃量÷大鼠体重）约为0.0、0.07、0.13、0.27、0.53 g/kg·bw/h，对运动1.5 h的大鼠，肽补充量为0.0、0.1、0.2、0.4、0.8 g/kg·bw，对运动3.0 h的大鼠，肽补充量为0.0、0.2、0.4、0.8和1.6 g/kg·bw。按大豆肽粉原料中含亮氨酸6.55%计算，亮氨酸补充量分别约为0.0、4.4、8.7、17.5、34.9 mg/kg·bw/h。

1.2.4 取材

大鼠运动1.5 h或3 h后即刻以水合氯醛腹腔注射麻醉取样，安静组10只大鼠中5只与1.5h运动组一起、5只与3 h运动组大鼠一起取样，运动组大鼠由于游泳期间有的大鼠呛水死亡，故最终个别组大鼠数为6～8只。腹主动脉取血后，用分离胶促凝管采集血液，室温放置约60分钟后4℃分离血清，放置在－20℃冰箱，第二天转入－80℃冰箱保存待用。

1.2.5 测试指标及仪器

本研究测试了血清19种FAA以及血氨（NH3）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）的浓度。FAA及NH3测试仪器为835型全自动氨基酸分析仪（日本日立公司），标准品购自Sigma公司。色谱条件：分析柱2.6 mm×150 mm不锈钢柱；树脂为日立#2619；柱温53℃；流速0.225 ml/min；压力80~130 kg/cm2；循环时间70 min；茚三酮流速0.3 ml/min、压力15~35 kg/cm2；标准浓度5 nmol/50 ml；氮气压力0.28 kg/cm2。BUN测试仪器为UniCelDxC600全自动生化分析仪，检测所用试剂为利德曼试剂盒，购自北京利德曼生化股份有限公司。

1.2.6 数据分析

数据以平均值±标准差（x±s）表示，应用Grubbs法处理离群值（GB/T 4883-2008）。使用SPSS软件的General Linear Model中Univariate法进行方差分析，将运动、肽补充设为固定变量（fixed factors），将两种运动时间（1.5 h和3.0 h）和几种肽补充量设为随机变量（random factors），对运动、肽补充、运动时间和肽补充量进行主效应分析，组间比较选用Bonferroni法，P<0.05表示有统计学意义。计算不同肽补充量后，与SC组比血清FAA的净变化率（%），并以此分析肽补充的量-效关系。

2 结果

2.1 血清各种FAA水平

表3显示，与SC组相比，EC组血清Val、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys浓度显著升高（P<0.05），Glu、Thr显著下降（P<0.05）；ES组与SC组比，血清Val、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys同样显著增加（P<0.01），但同时Tau、Arg和His增加也具有显著性（P<0.01），Glu仍显著低于SC组（P<0.05），但Thr则小幅增加并与SC组比较无显著差异；ES组与EC组比，Ala、Ile、Tyr、Thr、lys水平均显著升高（P<0.05）。运动3.0 h与运动1.5 h相比，血清Ala、Tyr、Pro、Arg显著下降（P<0.05），Val和牛磺酸（taurine，Tau）浓度显著升高（P<0.05）。

表3 大鼠血清各种FAA水平（续）

表3 大鼠血清各种FAA水平

图1显示，ES组中，不同运动时间（1.5 h与3.0 h）下，0.53 g/kg·bw/h肽补充量与其他肽补充量比，Ala、Glu、Val、Ile、Leu、Tyr、Thr、Pro、lys、Arg水平均显著增加（P<0.05），肽补充量0、0.07、0.13、0.27 g/kg·bw/h之间无显著差异。

2.2 总EAA含量

表4显示，与SC组相比，ES组EAA水平显著增加（P<0.01）。ES组中，0.53 g/kg·bw/h肽补充量2.4时EAA明显高于其他肽补充量（P<0.05），肽补充量0、0.07、0.13、0.27 g/kg·bw/h之间无显著差异（图1）。

2.3 BCAA、AAA、Trp含量及BCAA/AAA和Trp/BCAA比值

与SC组相比，ES组和EC组BCAA和AAA及其比值均显著增加（ES组P<0.01；EC组P<0.05）（表4），色氨酸（tryptophan，Trp）/BCAA比值显著下降（P<0.01）。运动3.0 h与1.5 h的BCAA无显著差异，但AAA明显降低（P<0.05），BCAA/AAA比值显著增加（P<0.01）。ES组中，肽补充量0.53 g/kg·bw/h时的BCAA、AAA明显高于其他肽补充量（P<0.05），肽补充量0、0.07、0.13、0.27 g/kg·bw/h间无显著差异（图1）。

2.4 碱性氨基酸和含硫氨基酸水平

与SC组相比，ES组和EC组BAA显著增加（ES组P<0.01；EC组P<0.05）；与SC组相比，ES组SCAA显著增加（P<0.05）（表4）。运动3.0 h与1.5 h间两类氨基酸无显著差异。ES组中，肽补充量肽补充量0.53 g/kg·bw/h的BAA水平明显高于其他剂量组（P<0.05），肽补充量0、0.07、0.13、0.27 g/kg·bw/h之间无显著差异（图1）。

2.5 血清NH 3及BUN水平

与SC组相比，EC组NH3无显著变化而BUN显著增加（P<0.01），ES组BUN增加明显（P<0.01）（表4）；与EC组比，ES组NH3和BUN均无显著差异；ES组中不同肽补充量间NH3和BUN均无显著差异，运动3.0 h与1.5 h比及不同肽补充量之间（图1），血NH3和BUN均无显著差异。

表4 大鼠血清各类总FAA水平及比值、NH 3和BUN水平

2.6 运动1.5 h和3.0 h后不同肽补充量与FAA水平的量-效关系及其相关分析

为分析不同肽补充量与血液FAA含量的量-效关系，我们以SC组为基准，分别计算了EC组和ES组运动1.5 h和3.0 h后，不同肽补充量后血液氨基酸的净变化率（%）及其相关性检验（图1）。

图1 运动1.5 h和3.0 h不同肽补充量后血液氨基酸水平变化率（%）及其相关分析

主要结果有：1）与SC组比，EC组运动3.0 h后其Ala、Glu、Tyr、Trp、Pro、Met、Ser、Arg及AAA和Trp/BCAA水平比运动1.5 h后降低更多（>20%），Val、Ile、Leu及BCAA和BCAA/AAA、BUN则增加更多（>20%）。2）无论是运动1.5 h还是3.0 h，随肽补充量增加，血液FAA大部分有不同程度增加。其中，运动1.5 h后，Val、Ile、Leu、Tyr、Pro、Asp、Arg、Lys、BCAA、BAA、BUN明显增加（>20%）；运动3.0 h后，Glu、Val、Ile、Tyr、Pro、Tau、Asp、Arg、Lys、BCAA、AAA、BAA增加（>20%），Trp/BCAA比值则明显下降（>20%）。

3 分析讨论

3.1 运动及补充P-CHO增加血清FAA水平

本研究结果显示，运动引起血液Val、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys及BUN浓度显著增加（EC组vs SC组），这提示，耐力游泳运动使大鼠体内蛋白质代谢分解加强，氨基酸释放到血液中，周转率加快[25]，氨基酸脱氨基生成的NH3并未升高，而BUN增加，说明NH3在肝脏代谢成BUN。而Glu、Thr显著下降，表明运动中体内蛋白质分解释放的Glu、Thr等氨基酸不能充分满足需求。

当运动中持续补充P-CHO后（ES组），与仅补充CHO比，运动并补充P-CHO（ES组vs SC组）对血液FAA水平产生叠加效应，在运动引起的上述几种氨基酸增加的基础上，Arg、His、Tau浓度也明显增加。另外，虽然Glu仍然降低，但降低幅度有所减小，Ala也有类似趋势。这表明：运动中补充P-CHO仍不能充分满足运动时对Glu以及随运动时间延长而显著下降的其他氨基酸如Ala、Tyr、Pro、Arg等的需求（表3、表4）。

从EC组与ES组之间比较的结果来看，运动中补肽对血清Ala、Ile、Tyr、Thr和Lys产生明显的增加效应。推测：可能运动中肽补充进一步提升了上述血清FAA的浓度水平，在一定程度上减少了运动中依赖骨骼肌蛋白质分解释放氨基酸。

与SC组相比，EC组和ES组几类氨基酸EAA、BCAA、AAA及其比值（BCAA/AAA和Trp/BCAA）以及BAA、SCAA等均出现相应改变（EC组/ES组vs SC组），运动对EAA的作用尚不显著，但运动中持续补充P-CHO使EAA增加显著（ES组vs EC组）（表4）。还有，运动及运动中补充P-CHO均使BCAA升高，尽管Trp无显著变化，但Trp/BCAA比值显著降低（ES组/EC组vs SC组，P<0.001）。这表明：运动中持续补充由大豆肽配制的P-CHO可明显提升EAA、BCAA、AAA及BCAA/AAA比值和BAA及SCAA，降低Trp/BCAA比值，这有利于提高氨基酸作为能量物质参与运动中氧化供能，并在一定程度上具有缓解中枢疲劳的作用。

3.2 肽补充量和运动时间对血清FAA水平的影响及其意义

血液FAA水平随肽补充量增加有不同程度增加，反映了肽补充的量-效应关系，无论是运动1.5 h还是3.0 h，只有肽补充量达0.53 g/kg·bw/h时，血清Ala、Glu、Val、Ile、Leu、Tyr、Thr、Pro、Gly、Arg、lys、His增加才具有显著性，这说明：单位时间肽补充量越高，吸收入血的氨基酸越多。尽管肽补充量为0.27 g/kg·bw/h及其以下时，血液某些氨基酸浓度随补充量增加亦有不同程度增加，但三种肽补充量（0.07、0.13、0.27 g/kg·bw/h）与单纯运动时补充CHO（EC组）相比没有显著差异。遗憾的是，本次实验未设计更高肽/糖比和仅补肽的组别。

本研究运动1.5 h和3.0 h结束时，肽补充总量分别为0.8 g和1.6 g/kg·bw（两者的补充速率g/kg·bw/h相同），总体上，从运动时间效应看，大部分增加的氨基酸似乎与运动时间长短关系不明显，但随运动时间延长，血液Val、Tau及BCAA/AAA增加，Ala、Tyr、Pro、Arg、Trp及AAA降低，提示：随运动时间延长，即使以0.53 g/kg·bw/h补充该P-CHO饮料，可满足大鼠持续运动3.0 h后血液Val、Tau及BCAA/AAA水平，甚至有“剩余”（运动引起的骨骼肌损伤使血液氨基酸升高是部分原因），但不能维持Ala、Tyr、Pro、Arg等的需求。也许，随着运动时间延长，其他能源物质逐渐耗竭，这几种氨基酸更多地补充糖代谢和三羧酸循环中的中间代谢物。另外，运动3.0 h并持续补充P-CHO后可降低AAA或Trp/BCAA比值，这对缓解中枢疲劳有益。但Tyr降低也许会减少其与糖代谢和三羧酸循环中间产物的相互转化。

蛋白质中EAA和Leu含量是衡量蛋白质能否很好满足运动机体需要（如改善运动能力、促进肌肉恢复）的关键指标。专家共识建议：运动员应一次均衡摄入20～40 g（0.25 g~0.5 g/kg·bw）的优质蛋白质（含EAA 8~10 g、Leu 700～3000 mg），可有效地促进骨骼肌蛋白质的合成[26，27]。Moore等[28]报道：抗阻运动后摄入20 g鸡蛋蛋白（含约8.6 g EAA）足以使骨骼肌蛋白质合成接近最大化。本研究所用的大豆肽为大豆蛋白经酶解而成，7种EAA含量达35.06%，Leu含量达6.55%，属于优质蛋白。按人体体重80 kg计算，本研究不同肽含量P-CHO补充后，其CHO摄入量为19 g/h，肽摄入量从高到低依次约为42.4、21.6、10.4、5.6 g/h，Leu摄入量约为2800、1400、700和350 mg/h（分别为34.9、17.5、8.7、4.4 mg/kg·bw/h）。CHO摄入量低于运动机体需求大约1.0 g/kg·bw/h的水平[29]，Leu摄入量大致在上述推荐值范围内，但比Nelson研究报道的运动后摄入Leu 10 g/h的蛋白-Leu复合成分而使运动员BCAA代谢饱和的推荐量还相差较多[27]，而与Rowlands报道的耐力运动后一次补充23 g蛋白质+5 g Leu即可促进骨骼肌蛋白质合成接近最大化[30]则比较接近。因此，根据结果分析，我们认为：以该大豆肽为原料配制的P-CHO饮料，肽补充量为~0.27 g/kg·bw/h时，可基本维持运动1.5 h运动机体的多种血液FAA稳定，对于1.5 h~3.0 h的运动，需要更大剂量的肽补充（>0.27~0.53 g/kg·bw/h）才能维持更高的血液FAA水平，以满足运动物质和能量代谢需求。

3.3 几种（类）氨基酸补肽后显著变化的意义

补肽后增加的血液FAA可输送到骨骼肌、肝脏等组织器官，部分氨基酸可通过转氨基作用，与糖代谢和三羧酸循环中的关键分子丙酮酸、乙酰辅酶A、a-酮戊二酸、琥珀酰辅酶A、延胡索酸和草酰乙酸等相互转化，实现氨基酸的生糖和生酮作用。例如，Ala通过丙氨酸-葡萄糖循环[31]为机体糖异生提供丙氨酸底物，以稳定血糖水平、增加碳水化合物供能。在3.0h的长时间运动后，血液Ala水平明显下降，补充P-CHO尤其是肽补充量达到0.53g/kg·bw/h后，血液Ala水平明显增加，起到缓解长时间运动血液Ala下降的趋势（Glu、Thr、Pro及Gly亦有类似趋势）。长时间运动出现中枢疲劳后，及时补充Glu可快速提高中枢神经系统兴奋性，继而恢复机体运动能力[32，33]，Ala又是肝脏合成糖原的重要前体物质[34，35]。

本研究结果显示，几种EAA（Lys、Trp、Phe、Met、Thr、Ile、Leu、Val），尤其是BCAA（Ile、Leu和Val）随肽补充量增加而增加，这些氨基酸对长时间运动中的肌肉能量供给至关重要[21]，它们或直接在骨骼肌供能、或运输到肝脏进行糖异生补充糖和合成糖原[4，35-37]。值得注意的是，单纯运动1.5 h和3.0 h并未使某些血液FAA下降，反而使之升高，这可能与运动中蛋白质分解增加有关；而补充P-CHO后，尤其是高的肽补充量后血液EAA、BCAA进一步升高，这可能因为运动中持续补充P-CHO更多地增加了大鼠对EAA和BCAA的摄入，EAA、BCAA浓度的升高可能在一定程度上会减少骨骼肌蛋白分解供能，对缓解运动性中枢疲劳也有一定作用[38]。本研究结果还显示，补充P-CHO、特别是高剂量补充并未使血液NH3增加，提示该补充量后机体足以将生成的NH3在肝脏转化为尿素（血液BUN增加），而不会抵消BCAA增加所产生的改善神经传导、减缓神经疲劳等益处[39]，这可能还与P-CHO补充后血液Arg增加有关，Arg在运动中有促进体内一氧化氮的生物合成，降低运动引起的体内NH3积累的作用[40，41]。

另外，由于大豆肽是所有氨基酸的混合物，氨基酸比例影响着其补充后血液FAA水平，并与运动强度、时间长短及是否同时补充糖有关，总的来说，运动中补充该大豆蛋白酶解所得大豆肽配制的P-CHO饮料对血液大多数FAA产生有益的综合效果。

4 结论

大豆蛋白是植物蛋白中氨基酸组成比较接近人体氨基酸组成的优质蛋白。本研究采用酶解方法生产的大豆肽含2～8个氨基酸。游泳耐力运动1.5 h和3.0 h中补充不同肽含量的肽-糖（P-CHO）饮料后，与单纯补蔗糖饮料（CHO）比，大多数血清游离氨基酸（FAA）水平随肽补充量增加而增加，其中，肽补充量为0.53 g/kg·bw/h与肽补充量为0.0、0.07、0.13、0.27 g/kg·bw/h比，差异显著，但0~0.27 g/kg·bw/h补充量之间的差异无显著性。这提示：以该大豆肽为原料配制的肽-糖（P-CHO）饮料，肽补充量小于0.27 g/kg·bw/h时，可基本维持机体运动1.5 h的多种血液FAA稳定，当运动1.5 h~3.0 h时，需要更大剂量的肽补充（0.27~0.53 g/kg·bw/h）才能维持更高的血液FAA[特别是支链氨基酸（BCAA）]）水平；同时降低色氨酸/支链氨基酸（Trp/BCAA），以满足运动中的物质和能量代谢需求，并可能有益于缓解运动中枢疲劳、减轻骨骼肌损伤。至于运动时长不同，随肽补充量增加，发生显著变化的FAA有所差别，其意义有待进一步探讨。