产IAA根内生菌的分离鉴定及对小麦促生效果

林国钦 张婷 左杰 何锦欣 蓝灿华 田宝玉

摘要：生長素在植物生长和发育中扮演着至关重要的作用。吲哚乙酸（IAA）的合成普遍被认为是植物根际细菌和根内生菌促进植物生长最为重要的机制之一。通过对番茄根产IAA内生菌菌株进行分离鉴定并进行促生效果研究，以期为开发生物肥料提供参考依据。采用组织研磨培养法，以TSA培养基为分离培养基，从番茄根分离纯化得到12株番茄根内生菌，并利用16S rDNA序列分析对菌株进行种属鉴定;随机选择3株内生菌菌株mr7、mr31及B21，进一步研究其产IAA能力以及对小麦的促生效果。结果表明：经16S rDNA序列分析鉴定，mr7、mr89为大肠杆菌属Enterobacter，mr31、mr58、B21、GG1、M2、M3、r11、F127、F165、F170为芽孢杆菌属Bacillus;其中mr7、mr31及B21分别为阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae、蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus和巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium。菌株mr7、mr31和B21都具有直接利用色氨酸合成IAA的能力;其中，菌株mr7的IAA产量为67.79mg·L-1、菌株mr31的IAA产量为86.00mg·L-1、菌株B21的IAA产量为15.48mg·L-1。平板试验结果表明，菌株mr7及菌株B21处理后的效果比菌株mr31好，但各菌株处理后小麦的根长及株高均低于对照，菌液不同组分及不同浓度处理后对小麦的促生效果无显著差异;盆栽试验结果表明，3株菌株处理后小麦的叶长、根长及株高均有一定的提高，并且主要促进小麦根的生长，其中以菌株B21的促生效果最佳，同一菌株使用7种不同接种方法处理后各方法间无显著差异。

关键词：番茄根内生菌;IAA合成;促生效果;微生物菌肥

中图分类号：S 476.1 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2022）04-0010-08

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2022.04.002

Isolation and Identification of IAA-producing Endophytic Bacteria andIts Growth-promoting Effect on the Growth of Wheat

LIN Guo-Qin， ZHANG Ting， ZUO Jie， HE Jin-Xin， LAN Can-Hua， TIAN Bao-Yv*

（Fujian Key Laboratory of Cellular Stress Response and Metabolic Regulation/College of

Life Science， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350108， China）

Abstract： Auxin plays an important role in the growth and development of plant. The synthesis of indole acetic acid （IAA） is generally considered to be one of the most important mechanisms for the rhizosphere bacteria and endophytic bacteria of plant to promote the growth of plant. In order to provide reference for the development of biological fertilizer， the strains of endophytes producing IAA from tomato roots were isolated and identified and their growth-promoting effect was studied. By using the tissue grinding culture technique， twelve strains of tomato endophytic bacteria were isolated and purified from tomato roots with TSA medium as the isolating medium. The genus identification of the strains was carried out by means of 16S rDNA sequence analysis. Three strains of tomato endophytic bacteria including mr7， mr31 and B21 were randomly selected to further study their capacity of producing IAA and the growth-promoting effect on wheat. The results showed that according to 16S rDNA sequence analysis， mr7 and mr89 belonged to Enterobacter， while mr31， mr58， B21， GG1， M2， M3， r11， F127， F165 and F170 belonged to Bacillus， among which mr7， mr31 and B21 were Enterobacter cloacae， Bacillus cereus and Bacillus megaterium， respectively. The strains of mr7， mr31 and B21 had the ability to synthesize IAA directly from threonine， among which the IAA yield of strain mr7， mr31 and B21 was67.79mg·L-1，86.00mg·L-1 and15.48mg·L-1， respectively. Theresults of plate test showed that the effect of strain mr7 and strain B21 after treatment was better than that of strain mr31， but the root length and plant height of wheat treated with each strain were lower than those of the control group， and there was no significant difference in the growth-promoting effect on wheat treated with different components and concentrations of bacteria solution. The results of pot experiment showed that the leaf length， root length and plant height of wheat treated with the three strains were improved to a certain extent， and they mainly promoted the growth of wheat roots， among which the strain B21 had the best growth-promoting effect. And there was no significant difference when treated with seven different inoculation methods for the same strain.9ACE96D3-02A5-479D-BA21-0456D911058B

Key words： Endophytic bacteria from tomato roots; Synthesis of IAA; Growth-promoting effect; Microbial fertilizer

随着人类社会的持续发展，为了在世界范围内提供充足的粮食，农业生产面临着巨大的挑战。而由于化肥以及农药长期以来大量的滥用，導致了土壤板结、耕地盐碱化等环境问题日益严重，这成为了农业生产限制因素之一[1-2]。此外，农药及化肥的使用也增加了农作物的化学残留，不利于食品安全。因此，开发利用绿色、安全、高效、可持续的微生物菌肥成了现代农业发展的必经之路。植物内生菌是指生活在健康植物组织中的一类微生物，可以通过合成调节植物生长的激素、降解土壤中难以利用的矿物质、改善营养条件、分泌抗菌物质、诱导植物产生系统抗性等方式直接或间接地促进植物生长[3-7]。狄义宁等

[8]从甘蔗中分离纯化获得589株甘蔗内生菌，其中12株具有固氮、溶磷、解钾、合成生长素等促生长特性。杨亚茹等[9]验证了内生菌荧光假单胞菌DLJ1和蜡状芽胞杆菌SZ5可以通过提高几丁质酶活性来提高植株对南方根结线虫的抗性。张沁怡等[10]以福州市闽侯县油菜种植基地的油菜根为材料，从中分离出多株具有产铁载体、生长素以及固氮能力的菌株，并且具有一定抑菌活性，可作为植物促生及病害防控的重要菌株来源。

植物激素调节着植物的所有生理过程，包括其生长、发育、营养分配以及对环境的适应;而在所有植物激素中，生长素是其中最为重要的一种，可以调控细胞的伸长、维管组织的发育等[11]。大部分根际促生菌都具有合成生长素的能力，这些细菌合成的生长素可以通过改变植物体内的生长素水平直接改善植物的生长发育[12-13]。Shashidar Asari等[14]通过将菌株Bacillus amyloliquefaciens UCMB5113接种于拟南芥上，发现菌株UCMB5113可以通过合成生长素及细胞分裂素促进侧根的生长和伸长以及根毛的形成来促进拟南芥的生长，但抑制了主根的伸长。李福艳等[15]从植物根际土壤中分离出3株高产IAA的菌株，对玉米及生菜进行促生长试验后发现3株菌株对植物都具有良好的促生效果。本研究从番茄根中分离出多株内生菌，其中菌株mr7为阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae、菌株mr31为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus、菌株B21为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium。进一步分析3株菌株产IAA能力情况，并通过小麦平板发芽试验以及盆栽试验评价3株内生菌对小麦幼苗的促生效果。旨在为理解植物内生菌的促生机制提供一定的理论依据，同时也为研究和开发新型、高效的微生物菌肥奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

番茄植物于2020年5月采集于福建省福州市闽侯蔬菜种植地，用于根内生菌菌株的分离和纯化。选取小麦种子作为研究菌株促生能力的供试植物。

1.2试验方法

1.2.1番茄根内生菌的分离、纯化及分子鉴定将采集的番茄根去除表层土壤，用自来水冲洗干净，再用无菌水冲洗3次。将番茄根置于无菌平板中，75%酒精消毒2 min后，用无菌水冲洗3次。将消毒后的番茄根充分研磨静置后得到菌悬液，对其进行梯度稀释后分别吸取100 μL涂布于胰蛋白胨大豆琼脂培养基（胰蛋白胨15.0 g，大豆蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水

1000 mL，pH 7.3±0.2）上，37℃培养18～24 h。根据稀释平板上菌落的形态、大小及颜色的不同挑取单菌落于胰蛋白胨大豆琼脂培养基上进行划线纯化，以保证获得的菌株为单一纯化的菌落。将分离纯化后菌株分别接种于2 mL的LB液体培养基（蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸馏水1000 mL，pH值7.1±0.1）中，37℃、120r·min-1摇床培养10～12 h。取600 μL菌液与200 μL已灭菌的80%甘油混合于1.5 mL无菌离心管中，-20℃冰箱保藏。

采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取番茄根内生菌基因组DNA。以提取的细菌基因组DNA为模板，采用细菌通用引物（27f：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′;1492r： 5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3′），PCR扩增细菌16S rDNA基因[16]。将所获得的PCR产物送至上海生工生物股份有限公司进行测序，对所获得的序列拼接后上传至NCBI进行分子鉴定。

1.2.2番茄根内生菌产IAA能力测定将待测菌株接种于2 mL LB液体培养基中，37℃、120r·min-1摇床培养10～12 h。检测OD600各菌株的菌液浓度接近0.5后，取80 μL菌液分别接种于2 mL含L-色氨酸的King氏培养基（酵母浸粉0.5 g，胰蛋白胨0.5 g，酪蛋白氨基酸0.5 g，葡萄糖0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，丙酮酸钠0.3 g，K2HPO4 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，L-色氨酸0.5 g，蒸馏水1000 mL，pH值7.2±0.2）和不含L-色氨酸的King氏培养基（酵母浸粉0.5 g，胰蛋白胨0.5 g，酪蛋白氨基酸0.5 g，葡萄糖0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，丙酮酸钠0.3 g，K2HPO4 0.3 g， MgSO4·7H2O 0.05 g，蒸馏水1000 mL，pH值7.2±0.2）中，对照组为无菌水处理，于28℃、120r·min-1摇床培养5 d。吸取1 mL菌液于1.5 mL离心管中，最大转速离心5 min，取100 μL上清液加入含有等体积S2比色液（取4.5 g FeCl3溶解于300 mL蒸馏水中，再缓慢加入98%浓硫酸587.4 mL，待溶液冷却后定容至1L，该比色液测定范围为5～200mg·L-1）的离心管中，混合均匀，避光静置30 min进行显色反应，观察颜色变化。9ACE96D3-02A5-479D-BA21-0456D911058B

使用分析纯吲哚-3-乙酸制备IAA标准液，其浓度（mg·L-1）分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mg·L-1。取各浓度IAA标准液分别加入等量的S2比色液，混匀后避光静置30 min，然后立刻用分光光度计测定OD530值，每个浓度梯度3个重复。以标准液浓度为横坐标，各浓度梯度对应的OD530值为纵坐标，绘制S2比色液的IAA浓度标准曲线。

利用3株菌株培养液离心所得的上清液进行显色反应，然后立刻利用分光光度计测定OD530值。根据所绘制标准液的标准曲线计算待测菌株的IAA产量，每个菌株3个重复。

1.2.3平板法测定菌株对小麦的促生效果将小麦种子放入水中浸泡3～5 h，待种子吸水饱满后置于75%酒精溶液中消毒1 min，用无菌水冲洗3次，再用5%NaClO消毒3 min，无菌水冲洗3次。将消毒好的小麦种子均匀放入装有湿润无菌滤纸的培养皿中，在28℃生化培养箱中黑暗下发芽10～12 h。次日，给每颗种子滴加100 μL活化并稀释好的菌液，以滴加无菌水作对照组。其中，各菌株的菌液先在离心机中以10000r·min-1离心5 min，分别取上清液和菌液沉淀备用。上清液和菌液沉淀的稀释梯度分别稀释1、10、100、1000、10000倍。将滴加菌液的小麦平板放入28℃生化培养箱中培养15 d，其间定期滴浇无菌水，15 d后测定小麦种子叶、根长及株高。

1.2.4盆栽法测定菌株对小麦的促生效果每个菌株采用7种方法对小麦进行处理：（1）菌液浸种;（2）小麦播种后将菌液撒在种子周围土壤中;（3）小麦发芽后将菌液撒在周围土壤中;（4）小麦长出3～4片真叶后将菌液撒在周围土壤中;（5）菌液浸种+小麦播种后将菌液撒在种子周围土壤中;（6）菌液浸种+小麦发芽后将菌液撒在周围土壤中;（7）菌液浸种+小麦长出3～4片真叶后将菌液撒在周围土壤中。每个处理3个重复，对照组加入等量无菌水。处理完毕后，将盆栽置于室外通风、光照良好的地方进行栽培并根据土壤的干湿程度适当浇水。栽培30 d后对小麦的叶长、根长以及株高进行测量并统计。利用SPSS软件对各试验组的株高、根长以及鲜重数据与对照组进行显著性检验，以确定试验组与对照组之间是否存在显著性差异。

2结果与分析

2.1番茄根内生菌的分离纯化及分子鉴定

根据平板上菌落的形状、大小以及颜色的不同，挑取单菌落并进行划线培养，最终得到纯化的番茄根内生菌12株。对分离所得菌株的16S rDNA基因进行PCR扩增，测序后的序列通过上传NCBI数据库进行分子鉴定，结果见表1。从表1可看出，从番茄根中分离得到的12株番茄根内生菌主要归属于芽孢杆菌属Bacillus和大肠杆菌属Enterobacter，其中包含10株芽孢杆菌和2株大肠杆菌;由此可见，芽孢杆菌在番茄根系的定殖中占据较高的优势。

2.2番茄根内生菌产IAA能力测定

从10株芽孢杆菌中随机挑出2株菌株（mr31和 B21），从2株肠桿菌中随机挑出1株菌株（mr7），用于进一步研究其产IAA能力及促生效果。将比色液与3株内生菌菌株在含L-色氨酸的King氏培养基中发酵后离心所得的上清液进行显色反应，比色液能使3株菌的上清液均变成红色，说明菌株mr7、mr31和B21都具有直接利用色氨酸合成IAA的能力;不含L-色氨酸的King氏培养基与比色液反应后不变色，说明菌株在培养基不含色氨酸的情况下无法合成IAA;添加无菌水的对照与比色液反应后不变色，说明底物（L-色氨酸）不与比色液反应。具体显色反应情况见表2及图1。

通过对分析纯吲哚-3-乙酸制备的IAA标准溶液与PC比色液进行显色反应，并利用分光光度计测定OD530的值后，绘制IAA标准溶液的标准曲线（表3、图2）。

根据标准曲线计算可得，从番茄根中分离出的3株植物内生菌经发酵培养后均具有较高的IAA产量。其中，菌株mr7的IAA产量为67.79mg·L-1、菌株mr31的IAA产量为86.00mg·L-1、菌株B21的IAA产量为15.48mg·L-1（表4）。

2.3平板法测定菌株对小麦的促生效果

由表5及表6可知，使用菌液的不同组分（上清液和沉淀菌液）对小麦种子进行处理后，小麦的各项指标均无显著差异，说明对小麦施加上清液和沉淀菌液后的促生效果几乎相同;与CK相比，各菌株处理后小麦的根长及株高均低于对照，而叶长与对照相比无显著差异，其中，经菌株mr7及菌株B21处理后小麦的根长及株高均显著高于菌株mr31处理后的效果;各菌株经不同浓度稀释处理后对小麦的促生效果无显著差异。

2.4盆栽法测定菌株对小麦的促生效果

小麦盆栽试验结果（表7、表8、表9）表明，与CK相比，3株菌株处理对小麦的叶长、根长和株高均有一定的促生作用，但对叶长及株高的促生效果不显著，而对根长的促生效果具有较高的显著性，其中，以菌株B21的促生效果最佳，菌株mr31和菌株mr7次之;在不同方法处理后，各方法对小麦叶长、根长及芽长的影响均无显著差异，说明使用不同方法对小麦施加菌液不影响各菌株对小麦的促生效果。

3结论与讨论

植物大部分的生理活动都是由一种或多种植物激素进行调控，主要包括生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯、水杨酸、茉莉酸和油菜素内酯等;而生长素作为其中对植物最重要且不可或缺的一部分，它不仅能在植物中发现，并且在细菌和真菌中都有被报道过[17-18]。研究表明，许多植物促生菌都具有合成生长素的能力，而芽孢杆菌因其具有产生芽孢的能力从而对各种环境胁迫有较高的抗逆性，此外，由于芽孢杆菌在各种生态位中均具有广泛的分布所以芽孢杆菌作为植物促生菌拥有十分广阔的应用前景[19]。张东艳等[20]从花生根际土壤中筛选出5株产IAA的促生菌菌株，其中以特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis（HS10）菌株产IAA能力最强，其产量可达52.03mg·L-1。闵勇等[21]利用Salkowski染色法对保藏的1920株芽孢杆菌进行了快速筛选，从中获得12株显色较为明显的芽孢杆菌，其中1株巴基斯坦赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus pakistanensis的IAA产量高达（118.23±5.55）mg·L-1。陈迪等[22]从槟榔根际土及叶柄分离出1种具有产IAA能力的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens（DC-7）菌株，其IAA产量可达（35.78±1.41）μg·mL-1。本研究从番茄根中分离筛选出3株具有产IAA能力的内生菌菌株，且菌株B21及菌株mr31均归属于芽孢杆菌属，其中巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium（B21）菌株的IAA产量为15.48mg·L-1、蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus（mr31）菌株的IAA产量为86.00mg·L-1。与先前的研究相比，本研究所筛选的2株芽孢杆菌也具有较好的IAA合成能力，因此利用芽孢杆菌作为开发微生物菌剂的菌株来源具有很高的潜力。9ACE96D3-02A5-479D-BA21-0456D911058B

有关研究表明，许多肠杆菌可以通过吸附土壤中的重金属、产生铁载体、溶磷、固氮等作用促进植物的生长[23-26]。而目前国内外有关肠杆菌产IAA能力的相关报道还比较少。张琳等[27]从药用植物三七中分离出1株产气肠杆菌Enterobacter aerogenes菌株（PN8），其IAA产量可达0.989μg·mL-1。徐幼平等[28]分离的阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae菌株（B8）的IAA产量可达904.38mg·L-1。本研究从番茄根中分离出1株具备产IAA能力的阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae菌株（mr7），并且其IAA产量可达67.79mg·L-1，也具备作为促生菌的菌株资源。然而有研究发现，肠杆菌不仅可以作为人类病原菌，同时也可以对多种农作物造成诸如枯萎、烂根等病害作用[29-30]，因此将肠杆菌应用到实际农业生产中还有待斟酌。

植物内生菌可以通过合成植物激素、固氮、溶磷、解钾等方式促进植物生长，其中生长素的合成是目前认为内生菌最主要的促生机制。刘鲁峰等[31]从甘蔗根中分离出1株内生枯草芽孢杆菌B9，具有合成IAA能力的特性，与对照相比接种该菌株后可以显著增加甘蔗的株高、根长、叶绿素含量等指标。李培根等[32]分离的阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai菌株（HL379）也具有合成IAA的能力，其IAA产量为47.8mg·L-1，能够提高马铃薯的株高、根长、鲜重及干重并增加马铃薯的产量。对从番茄根中分离出的3株内生菌进行接种小麦平板和小麦盆栽试验，结果表明，这3株内生菌对小麦均具有一定的促生作用。在平板试验中，将菌株发酵液离心分离出上清液和沉淀菌液后再进行梯度稀释最后接种于小麦平板中。结果显示，菌液的不同组分对小麦的促生效果无显著差异并且不同浓度菌液处理的促生效果无显著差异;在不同菌株处理间经菌株mr7及菌株B21处理后小麦的根长和株高显著高于菌株mr31处理后的效果，与对照相比各菌株处理后小麦的芽长和根长都相对较低，其原因可能是细菌产生的IAA浓度过高反而抑制了小麦的生长。在盆栽试验中，将3株菌株分别采用7种方法对小麦进行处理。与对照相比，3株菌株处理后小麦的叶长、根长和株高均有一定的提高，并且各菌株都能显著促进小麦根的生长，其中以菌株B21的促生效果最佳，菌株mr31和菌株mr7次之;在同种菌株的不同方法处理间，各方法处理后的效果无显著差异，说明使用不同方法对小麦滴加菌液不影响各菌株的促生效果。

相较于其他根际微生物，植物内生菌因其能够在植物体內获得相对稳定的生存空间，不易受到外界环境的影响，从而能够更好地发挥出其促生活性，可作为开发微生物菌肥的重要来源[33]。从当前的研究来看，文献中描述最多的植物内生菌属主要包括假单胞菌属、芽孢杆菌属、伯克霍尔德菌属、狭窄单胞菌属、微球菌属、泛菌属、微杆菌属、肠杆菌属、偶氮螺菌属和沙雷氏菌属等[34]。本研究以重要的经济作物番茄为材料，采用常规方法从番茄根系中分离纯化出12株番茄根内生菌，经分子鉴定后可知这12株菌株分别隶属于芽孢杆菌属和肠杆菌属，其中，包含10株芽孢杆菌和2株肠杆菌。试验结果表明，从番茄根中分离获得的内生菌主要为芽孢杆菌，说明芽孢杆菌在植物根系的定殖中占据较高的优势，可作为植物根内生菌促生活性及病害防控机制研究的重要菌株来源;此外，分离所得的肠杆菌也可以作为开发和利用微生物菌肥的研究对象。

本研究从番茄根中分离筛选出3株高产IAA的植物内生菌菌株，菌株mr7、mr31、B21分别被鉴定为阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae、蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。对菌株mr7、mr31、B21进行IAA合成能力测定及对小麦促生试验后，发现这3株菌株都具有合成IAA的能力，并在盆栽试验中对小麦根长表现出了较好的促生效果。然而，本研究只初步探讨了植物内生菌的促生机制及其对植物的促生效果，更深层次的相互分子调控机制及实际应用价值还有待进一步的探究，从而为开发高效环保的微生物菌肥提供理论基础。

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收稿日期：2022-03-28

作者简介：林国钦，男，1998年生，硕士，主要从事植物微生物组研究。

*通信作者：田宝玉，男，1973年生，博士，主要从事植物微生物组研究（E-mail：tianby@fjnu.edu.cn）。

基金项目：福建省自然科学基金项目（2020J01173）;福建省林业科技研究项目（2021FKJ31）;国家自然科学基金项目（31670125）。9ACE96D3-02A5-479D-BA21-0456D911058B