长链非编码RNA 参与调控细胞程序性死亡的研究进展

汪贝贝张文波蒋鹏程

(江苏大学附属人民医院普外科,江苏 镇江 212002)

细胞死亡在机体的生长发育过程中不可或缺,可按照意外因素或体内的分子调节机制的不同,分为意外细胞死亡和调节性细胞死亡(regulated cell death,RCD),在生理条件下,RCD 又被称为细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD),根据发生机制及生化形态特征,PCD 包含凋亡(apoptosis)、坏死性凋亡(necroptosis)、铁死亡(ferroptosis)、焦亡(pyroptosis)、自噬(autophagy)等多种形式[1]。 而根据细胞是否发生破裂,也可分为溶解性细胞死亡和非溶解性细胞死亡两类[2]。 不少研究表明PCD 可显著调控炎症、肿瘤等疾病的发生发展,而作为下游因子,PCD 在分子水平、蛋白水平、葡萄糖水平、线粒体功能等方面可受诸多因子调控,其中长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是关键的上游调控分子之一[3]。

长链非编码RNA 是转录物长于200 nt 的RNA,曾经被认为是“转录噪音”序列、RNA 聚合酶II 的副产物。 尽管无法翻译成蛋白质,但lncRNA从作为基因表达的调节器,到将遗传密码子翻译成蛋白质序列,都扮演着功能分子的角色,其在细胞核内参与遗传、转录的调控,在细胞质中可充当miRNA 的竞争性内源RNA(ceRNA)影响mRNA 翻译,并参与mRNA 后续的稳定以及降解过程的调节[4]。 lncRNA 在细胞的增值、迁移等多种生物学过程中发挥重要作用,同时PCD 作为研究的热点问题,近年来有较多lncRNA 参与其调控的研究报道,但目前尚缺乏归纳总结,本文就相应问题的最新研究展开综述,以期为细胞程序性死亡的调控和lncRNA 的功能研究提供新的思路。

1 lncRNA 与凋亡

凋亡是在一系列酶的参与下、受基因调控的主动且有序的过程,具有不同于坏死的形态学变化的一类PCD,细胞凋亡及其失调是许多疾病的病理生理过程的基础,包括细胞内稳态、组织重塑和肿瘤发生[5]。 凋亡主要包含线粒体途径和死亡受体途径两类经典途径。

线粒体途径中,在细胞应激或发育信号作用下,Bcl-2 家族蛋白的表达或功能受到相应调节,3种促进凋亡的Bcl-2 效应蛋白——Bax、Bak 和Bok可直接引起线粒体外膜通透性(MOMP)增加,从而将线粒体膜间隙蛋白释放到细胞质中,启动凋亡;而抑制凋亡的Bcl-2 蛋白包括Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1 和BFL/A1 等,及单个BH 区的BH3 蛋白Bid、Bim、Bad和Noxa 等则产生相反的效应[6]。 细胞中Bcl-2 蛋白的特异性和动态相互作用决定了MOMP 的发生与否。 而在死亡受体途径中,肿瘤坏死因子受体(TNFR) 与肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、Fas 配体(Fas L)等配体结合后,由细胞凋亡抑制因子(cellular inhibitor of apoptosis protein,cIAP)1 和肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor,TRAF)2 对受体相互作用蛋白激酶(receptor interacting serine/threonine protein kinase, RIPK)1 来进行了泛素化标记,再经去泛素化酶(cylindromatosis,CYLD)作用,形成肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白(TNFRassociated death domain,TRADD)/凋亡促进蛋白(Fas-associated protein with death domain,FADD)/半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(caspase)8/RIPK1/RIPK3和TRADD/FADD/caspase-8 两种复合体,当前者中caspase-8 激活时,使得caspase-3/7 成熟,或水解Bid,促进细胞凋亡,而后者可通过FADD 直接使得caspase-8 成熟,导致凋亡[7]。

lncRNA 可以通过影响凋亡相关蛋白的表达,参与线粒体途径的调控。 有研究用高糖处理lncRNA CA7-4 和si-CA7-4 转染后的血管内皮细胞,发现CA7-4 升高了Bax 和裂解的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(poly ADP-ribose polymerase-1,PARP1)的水平,促进血管内皮细胞的凋亡[8]。 此外,Li 等[9]研究发现miR-296-5p 直接结合Bax mRNA 的3’非翻译区,在mRNA 和蛋白质水平上抑制Bax 表达,而lncRNA KCNQ1OT1 作为一种有效的细胞凋亡促进因子,通过使miR-296-5p 海绵化,上调Bax,促进了神经母细胞瘤细胞凋亡。

lncRNA 亦可通过死亡受体途径调节凋亡的发生发展。 He 等[10]发现lncRNA GAS5 的过表达显著上调caspase-3 蛋白表达水平、促进平滑肌细胞凋亡且抑制其增殖,减少了平滑肌细胞的数量,从而参与调控腹主动脉瘤的形成。

lncRNA 还可以通过各种其它机制调节细胞凋亡,如Jiang 等[11]发现高水平的lncRNA RP11-468E2.5 表达可通过抑制JAK/STAT 信号通路来负调节信号转导和STAT5/6 的表达,从而抑制了大肠癌细胞的增殖并促进其凋亡。

2 lncRNA 与坏死性凋亡

坏死性凋亡是由RIPK1、RIPK3 和人混合系列蛋白激酶样结构域(mixed lineage kinase domain like protein,MLKL)介导的一种受调控的坏死细胞死亡形式,在凋亡缺乏的条件下可被激活[12]。

在TNFR1 参与的信号通路的研究中,TNFα 与TNFR1 的结合会触发如NF-κB 通路、细胞凋亡和坏死性凋亡的激活,亦会招募TRADD、TRAF2/5、RIPK1、cIAP1 组成复合体I。 cIAP1 对RIPK1 的多聚泛素化所募集的复合物TAK1(TAK1、TAB1 和TAB2),可解离激活转录因子NF-κB[13],而CYLD对RIPK1 去泛素化作用或抗坏死蛋白(A20)泛素编辑复合物抑制NF-κB 活化,并形成Necrosome 复合体,包 含caspase-8、 TRADD、 RIPK1、 RIPK3 和FADD[14]。 caspase-8 的活性对于确定细胞的命运至关重要,当缺失或被抑制时,RIPK1 和RIPK3 会互相激活磷酸化,进一步活化Necrosome 复合体,激活下游的MLKL 蛋白,致使膜通透性增强,损伤相关分子模式( damage associated molecular patterns,DAMPs)渗出;此外还会造成线粒体内活性氧(reactive oxygen species,ROS)累积,线粒体分裂,细胞发生坏死性凋亡[15-16]。 而当caspase-8 激活的情况下,caspase-8 会抑制RIPK1 和RIPK3 的磷酸化,Necrosome 复合体失活,导致细胞凋亡。

有研究表明,在敲低lncRNA TRINGS 或缺乏葡萄糖所诱导的死亡细胞内ATP 水平显著降低,高迁移率族蛋白B1 和乳酸脱氢酶的释放显著增加,表明TRINGS 低表达导致缺糖下的坏死性细胞死亡,且在形态学观察中,发现了细胞质膜破坏的坏死性凋亡表型的细胞,证明了这一结果[17-18]。 在缺乏葡萄糖时,p53 激活lncRNA TRINGS,上调的TRINGS与糖原合酶激酶-3β(GSK3β)竞争性地结合丝氨酸-苏氨酸激酶受体相关蛋白(STRAP),从而减弱了STRAP 和GSK3β 之间的相互作用,TRINGS 通过抑制STRAP/GSK3β/NF-κB 信号传导途径,使癌细胞免于坏死。

随着lncRNA 上的miRNA 识别元件的发现,miRNA-lncRNA 的相互作用增加了多方面转录后基因调控的复杂性[19]。 报道较多的为lncRNA 作为ceRNA 与 miRNA 相 互 作 用。 为 了 研 究lncRNA3037/miR-15a 轴在坏死性凋亡中的作用,Li等[20]发现敲除lncRNA 3037 显著提高了RIPK1、RIPK3、p-MLKL、Bax 和caspase-3 的表达,降低了miR-15a 靶基因抗凋亡蛋白(BCL2)和抗坏死蛋白(A20)的表达从而增加细胞凋亡率和坏死率。 同样的, lncRNA107053293 可 作 为 miR-148a-3p 的ceRNA,调控靶基因Fas 相关分子1 的表达,介导下游基因RIPK1 和RIPK3 的表达,诱导气管细胞发生坏死性凋亡[21]。 研究表明,敲除在肝细胞癌中高表达的lncRNA00176 时,会使肿瘤抑制因子miR-9 和miR-185 释放,从而影响细胞周期,造成肝癌细胞坏死性凋亡[22]。

MiRNA 和lncRNA 作为两种主要的调节性非编码RNA,不仅可以彼此相互作用,还可以作用于多种细胞内成分,参与细胞凋亡和坏死等PCD 调节[23],lncRNA 是否通过与其它的ncRNAs 的相互作用从而参与调控坏死性凋亡,有待进一步探索。

3 lncRNA 与铁死亡

2012 年Dixon 等[24]首次提出一种铁依赖性的调节性细胞死亡模式,通过不同的信号传导通路,最终导致细胞内部脂质ROS 物质的积累、脂质过氧化,从而诱导细胞死亡,被定义为铁死亡。

在较成熟的还原性谷胱甘肽(glutathione,GSH)/谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)调节通路中,胱氨酸通过细胞膜表面的胱氨酸-谷氨酸反转运受体(System Xc)转移至细胞内,进一步形成GSH,再经GPX4 形成氧化型谷胱甘肽。 这个过程会辅助GPX4 去除多不饱和脂肪酸的过氧化,从而抑制铁死亡的发生[25]。 循环铁与转铁蛋白以三价铁的形式结合,然后通过转铁蛋白受体1(TFR1)进入细胞,通过还原及脱蛋白,形成二价铁离子,再经芬顿反应,产生大量羟自由基,最终造成ROS 的累积,促进铁死亡的发生。 此外,肿瘤抑制蛋白p53 可以通过抑制System Xc 摄取胱氨酸,从而影响GPX4 的活性,导致细胞抗氧化能力下降、脂质ROS 积累和铁死亡[26]。 而Erastin 不仅可以通过抑制System Xc 摄取胱氨酸,还可以激活p53、影响脂质代谢等形式参与铁死亡的调控[27-28]。

在铁死亡中lncRNA 可以扮演ceRNA 的角色,Wang 等[29]证明在肺癌中lncRNA LINC00336 的过表达降低了铁浓度、脂质ROS 和线粒体超氧化物的表达,并增加了线粒体膜电位。 淋巴特异性解旋酶(LSH)通过失活p53 诱导类似胚胎致死性异常视觉基因的 RNA 结合蛋白1 表达, 后者通过与LINC00336 相互作用的转录调控提高了LINC00336的表达水平。 总之,LINC00336 吸收miR-6852 作为ceRNA,从而增加胱硫醚β 合成酶(cystathionineβsynthase,CBS;转硫途径活性的标志)的mRNA 水平,刺激细胞增殖,集落形成和肿瘤形成,并抑制肺癌细胞的铁死亡。 同样,Lu 等[30]发现miR-214 可以与lncRNA PVT1、p53 和TFR1 结合,miR-214 既可通过降低p53 水平从而抑制铁死亡的发生,亦可与TFR1 的3’UTR 结合,部分地通过TFR1 调节铁进入细胞内,参与铁死亡的调控。 研究结果表明,lncRNA PVT1 作为miR-214 的海绵,通过miR-214介导的p53 和TFR1 途径调节脑缺血再灌注中铁死亡的发生发展。

铁死亡还可以与其他类型的程序性死亡紧密相关。 LINC00618 通过上调Bax 蛋白和裂解的caspase-3 蛋白表达水平来促进细胞凋亡。 敲除LINC00618 显著降低了脂质ROS 水平,敲除组细胞在经长春新碱(VCR)和caspase 抑制剂VAD 处理后,较对照组细胞的脂质ROS 水平显著升高。 然而,当VCR 和Erastin 加入这些细胞时,它们对VCR诱导的铁死亡没有显著影响,表明铁死亡激活剂不会改变VCR 诱导的铁死亡和凋亡,而LINC00618 诱发的铁死亡依赖于VCR 诱发的凋亡。 过表达LINC00618 的细胞中LSH 和溶质载体家族7 成员11(SLC7A11)的表达水平均降低,LSH 与SLC7A11的启动子区域结合,增强SLC7A11 的转录,表明LINC00618 可抑制LSH 诱导的SLC7A11 的表达,促进依赖于细胞凋亡的铁死亡发生[31]。

4 lncRNA 与焦亡

2001 年Cookson 等[32]观察到一种caspase-1 依赖性的死亡的现象出现在被感染的巨噬细胞中,将其命名为细胞焦亡,不同于细胞凋亡,焦亡的形态学变化在体外没有DNA 片段化,但存在细胞核凝聚和细胞肿胀,最终破裂。

细胞焦亡有经由NOD 样受体的经典途径及通过JAK/STAT1 的非经典途径两类,在细胞在受到病原体或者外部损伤后,会分别激活JAK 和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor pyrin, NLRP;NOD 样受体蛋白)/凋亡相关斑点样蛋白(apoptosisassociated speck-like protein containing CARD,ASC)/Pro-caspase-1 复合体。 后者水解形成为成熟的caspase-1,而JAK 则传递到下游的STAT1,形成STAT1 二聚体,入核激活caspase-4/11 的转录,成熟的caspase-1 或者caspase-4/11 和caspase-5 的复合体,水解Gasdermin D(GSDMD),生成的GSDMDPFD 可以在膜上形成多聚体管孔,引起细胞内渗透压的变化、大量的DAMPs 分子涌出、细胞肿胀而破裂死亡[33]。 在缺乏GSDMD 的情况下,caspase-1 可以裂解并激活半胱氨酸蛋白酶,并且还可以裂解并激活Bid 以参与MOMP。 因此,在没有GSDMD 的情况下,caspase-1 激活会导致细胞凋亡[34]。

近年来,lncRNA 参与焦亡过程调控的研究报道很多,Yang 等[35]发现lncRNA KCNQ1OT1 可以作为miR-214-3p 的 ceRNA, 增强糖尿病心肌病中caspase-1 的表达来加速高糖诱导的成纤维细胞的焦亡;且在抑制KCNQ1OT1 后,GSDMD-N 蛋白表达水平发生逆转而呈严重下降趋势。 类似的调控方式在糖尿病性角膜内皮功能障碍中被报道[36]。 除此之外,最新研究发现lncRNA MIAT 可与CASP1 竞争结合miR-342-3p,从而减轻对miR-342-3p 靶基因CASP1 表达的抑制作用,从而促进caspase-1 介导的人视网膜外膜细胞焦亡[37]。 无独有偶,Liang 等[38]发现lncRNA MEG3 通过海绵吸附miR-485 抑制黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2,AIM2)的表达,缺乏MEG3 可抑制caspase-1 信号转导,降低AIM2、ASC、裂解的caspase-1 和GSDMD-N 的表达,敲除MEG3 可抑制氧糖剥夺后再复糖复氧所诱导的焦亡和炎症反应。

lncRNA 还可以通过介导NLRP 的表达参与焦亡的调控过程。 在缺氧心肌细胞中,人间充质干细胞分泌的lncRNA KLF3-AS1 通过作为ceRNA 与miR-138-5p 结合,促进沉默信息调节因子1(Sirt1)的表达,后者可以抑制NLRP3 炎症小体的激活,从而下调焦亡的表达[39]。 Wan 等[40]报道了过表达的lncRNA H19 与程序性细胞死亡因子4 竞争miR-21,形成ceRNA 网络,H19 介导其触发了NLRP3/NLRP6 炎性小体的相互激活,募集活化的caspase-1来切割GSDMD,从而引发小胶质细胞焦亡。 而lncRNA GAS5 既参与凋亡的调控,GAS5 的DNA 甲基转移酶1 甲基化通过影响NLRP3 轴也参与调控心肌成纤维细胞焦亡[41]。

另外还有其他的方式参与焦亡的调控,如Toll样受体4 在脊髓损伤后被激活,进一步磷酸化STAT1 并促进了lncRNA-F630028O10Rik 的表达,该lncRNA 充当miR-1231-5p/Col1a1 轴的ceRNA,并通过激活PI3K/ AKT 途径增强脊髓损伤后的小胶质细胞焦亡[42]。

5 lncRNA 与自噬

自噬是指在病原体因素、内质网应激下真核细胞通过形成双膜限制的自噬小体,将受损或多余的物质从细胞质中隔离出来,并与溶酶体融合,分解的物质可以再利用,以完成自身代谢需要、细胞器的更新、维持细胞稳态的过程[43]。

在哺乳动物中,巨自噬是研究最为广泛的一种经典类型,另外还有微自噬和分子伴侣介导的自噬。 不同的自噬相关基因(autophagy related genes,ATG)蛋白组成复合物,作为自噬机制的调节核心,负责自噬的诱导、自噬小体的形成、运输以及与溶酶体的融合[44]。 自噬的启动始于UNC-51 样激酶-1(UNC-51-like kinase 1,ULK1)复合物的激活,当雷帕霉素复合物1(mammalian target of rapamycin1,mTORC1)的活性受抑制,ATG13 的快速去磷酸化作用可以促进自身与ULK-1、粘着斑激酶家族相互作用蛋白和ATG101 之间形成稳定的复合物。 该复合物调节PI3K 复合物向内质网的转运,从而促进隔离膜的成核和组装;ATG12-ATG5-ATG16L1 复合物移至噬菌体装配位点,并使微管相关蛋白1-轻链3(亦被称为ATG 8 或LC3) 与磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)结合形成ATG 8-PE复合物,这促进了自噬体膜的伸长并形成自噬体,随后与溶酶体融合而发育成熟[45-46]。 自噬在细胞生存和死亡中均扮演着重要角色,且与凋亡存在Beclin1、p53、ROS 等共同的调节因子。 自噬不仅能够促进或抑制凋亡,甚至可与凋亡同时发生,或在特定情况下相互转化或协同作用[47]。 下文中我们将主要探讨lncRNA 参与自噬样死亡的调控。

部分 lncRNA 通过影响雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的表达,参与自噬过程的调控。 lncRNA FA2H-2 通过在转录水平抑制了MLKL 的表达,从而抑制了mTOR 依赖性信号通路的激活促进动脉粥样硬化中自噬的发生发展[48]。 P53 作为常见的抑癌基因,通过激活mTOR 的上游因子,参与自噬的调节,Liu 等[49]研究发现,lncRNA CAIF 通过与p53 蛋白直接相结合,阻断其介导的心肌素转录,下调心肌素的表达水平,抑制了p53-心肌素信号转导的心肌细胞自噬。

某些lncRNA 通过介导自噬小体的形成参与自噬的调控。 Li 等[50]发现lncRNA ZNNT1 的过表达显著增加了葡萄膜黑色素瘤细胞中LC3-I 到LC3-II的转化以及自噬底物受体SQSTM1(又称p62)的降解,促进细胞自噬。 相反, Zhang 等[51]报道了lncRNA CRNDE 下调LC3-II 的表达显著抑制胃癌细胞自噬。 除了针对LC3 之外,一些lncRNA 还介导了ATG 的表达,有研究发现lncRNA PVT1 通过上调LC3-II 的表达水平而减少p62 的含量,而消耗ATG14 可以恢复胰腺癌细胞中的这些影响,最终表明PVT1/miR-619-5p 轴通过调节ATG14 促进自噬活性[52];类似的,lncRNA EIF3J-DT 通过直接结合来增强ATG14 mRNA 的稳定性,并通过与miR-188-3p竞争性结合来阻止ATG14 mRNA 的降解,从而上调ATG14 的表达,促进自噬[53]。

除此之外一些研究者证实lncRNA H19 通过抑制了DNA 甲基转移酶 (DNA methyltransferase,DNMT) 3B 直接与Beclin1(参与形成PI3K 复合体)启动子的区域结合,上调了Beclin1 的表达水平并促进了自噬[54]。

6 其它类型的细胞程序性死亡

除上文所述之外还有报道较少的RCD[1]。 如依赖性细胞死亡(parthanatos)、内在性细胞死亡(entotic cell death)、网织状细胞死亡(netotic cell death)、溶酶体依赖性细胞死亡(lysosome-dependent cell death,LCD)、自噬依赖性细胞死亡(autophagydependent cell death)、碱死亡(alkaliptosis)和氧自由基诱导死亡(oxeiptosis)。 这些PCD 的具体机制尚在研究中,目前虽未有lncRNA 参与其调控的报道,但不同类型PCD 之间存在关联,如溶酶体膜透化不仅发生在LCD 中,还可以在细胞凋亡、铁死亡等其它PCD 中放大细胞死亡信号传导,使得细胞死亡途径变得更加复杂[55]。 临床方面如碱死亡在胰腺癌中的作用被开始挖掘[56],近几年来一种新概念PANoptosis 出现在研究的视野中,它是一种独特的、生理相关的炎症性程序性细胞死亡途径,由特定的触发因子激活,结合了凋亡、坏死性凋亡、焦亡三种类型PCD 的关键因子,在免疫领域发挥了相应的临床价值[57]。 相信陆续会有更多的相关报道,这些细胞程序性死亡与lncRNA 的相互作用机制也未尝不可作为新的研究方向。

7 总结与展望

PCD 作为近年来研究的热点领域,在炎症、肿瘤等方面均有着突破性的进展,而lncRNA 不仅在基因的表达过程中充当调节因子,同样也参与了PCD 的调控,本文综述了近年来lncRNA 与几种常见的PCD 相互作用的研究进展(见表1),这对研究lncRNA 参与调控PCD 的机制的进一步探索以及发掘新的研究方向有一定的意义。 同一种的lncRNA,如MEG3、H19 等参与不同类别的PCD。 不同类型的PCD 之间亦存在相互作用、有些存在类似的调节因子,如铁死亡被认为依赖于自噬的发生,两者之间存在p53、STAT3、GPX4 等近10 种共有的调节蛋白;ROS 诱导既可以参与坏死性凋亡,也介导铁死亡的发生,但目前未见有lncRNA 直接或间接参与调控此类关键因子,从而串联多种PCD 的研究报道。 同时lncRNA 作为肿瘤诊断及治疗的潜在靶点被相继报道,而另一些如lncRNA ZNNT1 既诱导自噬又抑制了肿瘤的发生,lncRNA 通过一种或是多种PCD 在肿瘤发生发展中的具体机制,仍需深入研究。 lncRNA 与PCD 的关系或将为肿瘤及其它疾病的诊疗提供新的思路。

表1 lncRNA 在细胞程序性死亡中的作用Table 1 Role of lncRNA in programmed cell death