内质网应激-线粒体自噬通路在大鼠肺动脉高压中的作用观察

武 云闫倩芝王 捷张敏芳王 瑞王世超

(1.新疆医科大学第一附属医院全科医学科,乌鲁木齐 830054;2.新疆医科大学第一附属医院药学部,乌鲁木齐 830054;3.新疆医科大学电镜室,乌鲁木齐 830054)

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)是各种原因引起的静息状态下右心导管测得的肺动脉平均压(mean pulmonary arterial pressure,mPAP)≥25 mmHg 的一组临床常见病症,肺血管重构是其重要的病理生理过程。 这类患者因长期缺氧导致行动缓慢,稍有活动便呼吸急促,日常生活严重受限,病死率高,预后极差。 内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)在肺血管重构所致的肺动脉高压发生发展中发挥重要作用[1-2]。 本研究前期证实,通过抑制ERS 可以降低PAH 大鼠肺动脉压力,减轻肺血管重构[3]。

ERS 与线粒体自噬的相互作用是引起细胞增殖的机制之一[4-5]。 研究发现,肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)增殖是导致PAH 肺血管重构的重要因素之一,线粒体自噬在其中发挥关键性作用[6-7]。 但是,ERS 是否通过线粒体自噬途径在其中发挥作用,目前研究较少。 因此,本研究在前期实验基础上,利用ERS 抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)干预野百合碱诱导的PAH 大鼠,采用病理染色、电镜、分子生物学方法观察肺血管重构、PASMCs 细胞线粒体形态及ERS-线粒体自噬通路相关因子的mRNA水平,为PAH 防治研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

采用6~8 周健康雄性SPF 级SD 大鼠45 只,体重180~200 g,动物购于新疆医科大学第一附属医院研究中心实验动物科学研究部[SCXK(新)2018-0002]),置于新疆医科大学鲤鱼山校区实验动物中心饲养[SYXK(新)2018-0003]。 统一在温度22℃~25℃,湿度50%~70%,昼夜各半循环照明饲养4 周后用于研究。 本实验严格遵循美国国立卫生研究院所指定的《实验动物实验指南》,并严格按照3R 原则[8],研究方案通过新疆医科大学实验动物伦理委员会审批(IACUC20190416-01)。

1.2 主要试剂与仪器

野百合碱(P19J8F40161,上海源叶生物科技有限公司);4-苯基丁酸钠盐(P10083,北京谨明生物科技有限公司);TRIzol 总RNA 提取试剂(UN 7E262I8,美国Invitrogen 公司生产);实时荧光定量PCR( quantitative real time PCR,qPCR) 引物合成,primer express 2.0 软件设计,上海生工生物技术有限公司合成;qPCR 试剂盒(P200601,上海凯杰企业管理有限公司(Qiagen))。

BL-420F 生物信息采集系统(成都泰盟);病理分析软件Image J、JSM-6390LV 扫描电镜(日本电子株式会社);QL-902 涡旋振荡仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司); Centrifuge 5415D 离心机(Eppendorf);NANODROP 2000 分光光度计(Therno scientific); ABI7500 荧光定量PCR 仪(Applied Biosystems)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型制备及分组

将SD 大鼠随机分为3 组,每组n=15:(1)NC组为正常对照组;(2)PAH 组为野百合碱诱导的PAH 模型组;(3)4-PBA 组为4-PBA 药物干预组。本研究按照以往实验采用一次性腹腔注射野百合碱诱导的方法建立PAH 模型[3]。 4-PBA 组为PAH建模同时按照500 mg/(kg·d)剂量给大鼠灌服4-PBA 混悬液,持续4 周。 NC 组及PAH 组接受同等剂量0.9%氯化钠溶液灌服,持续4 周。

1.3.2 血流动力学指标测定

测定方法与前期实验相同[3]。 测定并记录平均右心室压力(mean right ventricular pressure,mRVP)、平均肺动脉压力(mean pulmonary arterial pressure,mPAP)。

1.3.3 大鼠肺血管重构指标测定

实验大鼠处死后,从右肺门横断面取材,取肺组织2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm 大小,立即置入10%甲醛溶液中进行固定。 后期行HE 染色,用Image J分析软件测定肺血管重构相关病理指标,如肺细小动脉中膜厚度(medial wall thickness,MWT)、血管外径(external diameter,ED)、管腔面积(vascular lumen area,VA)、管壁面积(vascular wall area,WA)、管总面积(total vascular area,TA),计算肺细小动脉中膜厚度百分比MWT%(MWT%=2×WT/ED),管壁面积/管总面积比例WA%(WA%=WA/TA),管腔面积/管总面积比例VA%(VA%=VA/TA)作为肺小动脉重塑的指标。

1.3.4 大鼠PASMCs 电镜观察

实验大鼠处死后,切取0.5 mm3肺组织,立即投入到0.1 mol/L(pH=7.4)的二甲砷酸钠缓冲液配制的2.5%戊二醛中固定2 h(4℃冰箱中)。 采用0.1 mol/L(pH=7.4)的二甲砷酸钠缓冲液洗脱后,再放入用相同缓冲液配制的1%锇酸中固定2 h(4℃),脱水后切片,并电镜下观察。

1.3.5 内质网应激-线粒体通路关键因子mRNA测定

按照参考文献的方法[9],采用TRIzol 总RNA提取试剂进行样本RNA 提取,以GAPDH为内参。根据Real-time PCR 反应体系配制反应液。 在PCR反应管中分别加入ddH2O、SybrGreen qPCR Master Mix、Forward primer、Reverse primer、cDNA 模板,并充分混匀。 扩增程序为:95℃10 min,(95℃10 s,58℃30 s, 72℃10 s) ×40 个循环。 采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析,计算出各样品的目的基因相对定量结果,目的基因引物合成见表1。

表1 目的基因引物列表Table 1 Primers used in quantitative real-time PCR assays

1.4 统计学方法

血流动力学指标和ESR-线粒体自噬关键因子测定中的计量资料以平均数±标准误差(±sˉx)表示,肺血管重构指标中的计量资料以平均数±标准差(±s)表示,采用SPSS 22.0 进行统计处理,统计检测均基于双尾。 多组比较采用单因素方差分析及SNK-q检验,以α=0.05 为检验水准,P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血流动力学测定结果:

均显著下降,差异具有统计学意义(P<0.001)(见表2)。

表2 各组大鼠血流动力学指标测定Table 2 Hemodynamic indexes of rats in each group

2.2 各组大鼠肺血管重构病理指标测定结果

采用野百合碱诱导方法建立大鼠PAH 模型后,肺组织HE 染色可见大鼠肺小动脉管壁增厚、管腔狭窄,血管平滑肌细胞排列紊乱,肺间质充血,炎症细胞浸润明显。 经过4-PBA 干预后,大鼠肺小动脉管壁变薄,肺间质充血减轻(见图1)。 采用在Image J 软件测量各组肺血管重塑相关指标,与NC 组相比,PAH 组大鼠MWT%、WA%增高,VA%减少,提示PAH 组大鼠肺动脉管壁增厚、管腔狭窄,差异具有统计学意义(P<0.05)。 4-PBA 干预后,与PAH组相比,药物干预组大鼠上述肺血管重塑指标改善,差异具有统计学意义(P<0.05)(见图2)。 病理检测指标提示,采用ERS 抑制剂4-PBA 后,PAH 大鼠肺组织肺血管重塑指标得到改善。

图1 各组大鼠肺组织HE 染色Figure 1 Lung histology examples of rats were stained by hematoxylin-eosin

实验4 周后,应用生物信息采集系统测定各组大鼠的mPAP 和mRVP。 与NC 组相比,野百合碱诱导的PAH 组大鼠mPAP、mRVP 均显著升高,差异具有统计学意义(P<0.001)。 采用4-PBA 干预后,与PAH 组相比,药物干预组大鼠mPAP、mRVP

注:与PAH 组相比,∗P<0.05。图2 各组大鼠肺血管重塑指标测定Note. Compared with PAH group, ∗P<0.05.Figure 2 Measurement of pulmonary vascular remodeling indexes of rats in each group

2.3 电镜下各组大鼠PASMCs 线粒体表现

与NC 组相比,野百合碱诱导的PAH 组大鼠PASMCs 线粒体肿胀、线粒体嵴结构破坏,溶解消失,可见线粒体自噬现象增多。 经过4-PBA 干预的大鼠PASMCs 中线粒体结构改善,线粒体自噬减少(见图3)。

2.4 各组大鼠肺组织ERS-线粒体通路关键因子mRNA 测定结果

野百合碱诱导的PAH 组大鼠肺组织内质网应激相关因子PERK、ATF4、Bcl-2、CHOP 的mRNA 表达水平上调(P<0.001),线粒体融合因子Mfn2 的mRNA 表达水平下调,线粒体分裂因子Drp1 的mRNA 表达上调(P<0.001),线粒体自噬相关因子Atg12、LC3、p62 的mRNA 表达上调(P<0.001)。 经过4-PBA 干预后,与PAH 组相比,药物干预组大鼠内质网应激相关因子PERK、ATF4、Bcl-2、CHOP 的mRNA 表达水平下降(P<0.001),线粒体融合因子Mfn2 的mRNA 表达上调,提示线粒体融合增加(P<0.001),线粒体分裂关键因子Drp1 的mRNA 减少(P<0.001),线粒体自噬因子Atg12、LC3、p62 的mRNA 表达水平降低(P<0.01)(见图4)。

注:与PAH 组相比,∗∗P<0.01,∗∗∗P<0.001。图4 各组大鼠肺组织内质网应激-线粒体通路关键因子mRNA 测定Note. Compared with PAH group, ∗∗P<0.01,∗∗∗P<0.001.Figure 4 mRNA determination of key factors of ERS-mitochondrial pathway in lung tissue of rats in each group

注:黄色箭头:线粒体肿胀、嵴结构紊乱、消失;红色箭头:线粒体自噬现象。图3 各组大鼠PASMCs 线粒体超微结构表现Note. Yellow arrow, Mitochondria are swollen, cristae are disorganized and disappeared. Red arrow, Mitochondrial autophagy.Figure 3 Mitochondrial ultrastructure of pulmonary vascular smooth muscle cells of rats in each group

3 讨论

多项研究表明,ERS 是PAH 发生发展中的重要病理机制[9-12]。 本研究前期已证实,野百合碱诱导的PAH 大鼠肺组织中内质网应激关键通路PERK、ATF6、IRE1 关键因子的的mRNA 及蛋白表达水平均上调,而ERA 抑制剂4-PBA 可有效抑制ERS 关键因子,抑制肺血管重构,降低肺动脉压力[3],但其具体调控机制有待进一步研究。

近年来,内质网-线粒体功能紊乱导致肺血管重构的机制研究已经成为肺动脉高压领域的研究热点之一。 内质网与线粒体之间由线粒体结合内质网膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes,MAMs)相连,它是一种对细胞生理环境高度敏感的动态结构,主要参与调控ERS、氧化应激、细胞凋亡、细胞自噬、线粒体动态变化和炎症等[13]。 研究发现,抑制ERS 可以影响线粒体融合与分裂,从而导致线粒体结构紊乱[14-15]。 线粒体融合蛋白2(mitofusin-2,Mfn2)是一种具有三磷酸鸟苷活性的动力蛋白相关蛋白,其物理结构位于MAM一端,锚定于线粒体外膜,可以与内质网上的Mfn2结合形成二聚体,连接线粒体与内质网,主要功能是调控线粒体外膜融合,但是也与内质网应激中蛋白激酶 R 样内质网激酶抗原( PRKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)偶联负向调节ERS[16]。 McLelland 等[17]发现,通过催化Mfn2 泛素化,可引起线粒体外结合膜上Mfn2/p97 复合物分离,从而导致内质网-线粒体结合膜的破坏及线粒体自噬发生。 动力蛋白相关蛋白 1 (dynaminrelatedprotein 1, Drp1)是调节线粒体分裂的关键蛋白,Drp1 可通过形成螺旋寡聚体,包裹线粒体外膜并将其分裂[18]。 Shirakabe 等[19]发现,敲除Drp1,可使线粒体自噬减少。 本研究发现,在PAH 大鼠肺组织Mfn2 的mRNA 表达下调,Drp1 的mRNA 表达上调,采用ERS 抑制剂4-PBA 后,Mfn2 的mRNA 表达上调,Drp1 的mRNA 表达上调,提示线粒体融合增加,分裂减少。 因此,我们推测ERS 与线粒体融合分裂之间的相互作用可能在PAH 的发生发展中发挥重要作用。

近年来有研究发现, 线粒体自噬在增加PASMCs 增殖、抑制细胞凋亡方面发挥重要作用。在一项低氧PASMCs 模型研究中发现,低氧可激活线粒体自噬引起PASMCs 增殖,其过程与ERS 密切相关[20]。 本研究在电镜下观察PAH 大鼠肺组织PASMCs 线粒体形态变化的时发现,线粒体自噬现象增加,且采用ERS 抑制剂4-PBA 干预后这一现象明显减少。 进一步检测线粒体自噬相关因子LC3、Atg12、p62 的mRNA 表达水平,发现这些信号分子的mRNA 表达均减低。 研究发现,LC3 是参与自噬的重要蛋白。 在自噬中以LC3Ⅰ、LC3Ⅱ两种形式存在,LC3Ⅱ/Ⅰ比值的大小可以反映自噬水平的高低。 在自噬发生过程中,LC3Ⅰ与磷酯酰乙醇胺结合后形成LC3Ⅱ。 选择性自噬受体p62 蛋白通过与LC3Ⅱ特异性结合将泛素化的蛋白聚集体或者其它细胞组分募集到自噬小体中,然后在自噬溶酶体内降解,在低氧或炎症诱导的动物肺动脉高压模型中发挥作用[21]。 Atg12 是一种泛素样蛋白,在自噬通路中起着关键作用,是自噬小体形成必不可少的因子[22]。 基于此,我们推测4-PBA 抑制ERS 可能通过干扰线粒体融合与分裂,减少线粒体自噬从而达到保护PASMCs、抑制肺血管重构的作用(见图5)。

图5 4-PBA 抑制PASMC 内质网应激-线粒体自噬的信号通路和作用的假设模型Figure 5 A hypothetical model for the signaling pathway and the role of 4-PBA-inhibited ERS-mitochondrial in PASMC

本研究在ERS-线粒体自噬通路在PAH 发生发展中可能发挥重要作用方面仅仅做了初步的探索,存在一定的局限性。 首先,p62、Atg12、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ等线粒体自噬相关信号分子在蛋白和mRNA 水平的表达与调控分子机制仍有待进一步验证和研究。 其次,内质网与线粒体作为细胞中重要的两个细胞器,两者间的相互作用对PASMCs 过度增殖导致肺动脉狭窄诱发PAH 的具体机制仍有待探索。 此外,需要开展深入的分子生物学研究和大规模的临床验证研究来进一步探索和验证ERS-线粒体自噬通路中的关键因子,以期开发出以抑制PASMCs 过度增殖为治疗靶点的新型靶向治疗药物。