鸭坦布苏病毒与大肠杆菌混合感染的实验室诊断

沈思思

（黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江 齐齐哈尔 161000）

鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus, DTMUV）是单股正链RNA虫媒病毒，基因组长为11kb，有一个开放阅读框，两侧是5′端和3′端的非编码区，包含三种结构蛋白：衣壳（C）蛋白、前膜（PrM）蛋白和包膜（E）蛋白；七种非结构蛋白：NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5[1]。该病毒属于黄病毒科、黄病毒属，自2010年在我国东南部暴发以来，给我国的养鸭业造成了巨大的经济损失，该病毒的典型特征为鸭的产蛋量下降和神经症状[2]。

齐齐哈尔市某养殖场圈养4 000只鸭，接种过禽流感三价苗、鸭瘟疫苗、新流油乳剂疫苗和鸭细小病毒疫苗。送检的5只病鸭在发病期间出现绿色稀便、厌食、共济失调等症状。剖检发现肝脏、脾脏和脑出现典型病变，卵巢受损并出血。根据临床症状和病理剖检初步怀疑是坦布苏病毒和大肠杆菌混合感染，确诊需实验室诊断。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集采集病鸭的相关病料，包括：脾、肝、脑、卵巢、小肠。

1.1.2 主要仪器与试剂DNA、RNA提取试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；cDNA反转录试剂盒、Taq酶购自宝生物工程（大连）有限公司；离心机（TGL-16G）为上海安亭科学仪器厂产品；PCR仪（S1000）为美国伯乐公司产品；凝胶成像仪（WD-9413B）为北京六一仪器厂产品。

1.2 方法

1.2.1 被检样本处理解剖时，无菌采集病料于麦康凯培养基上，37 ℃ 过夜培养，革兰氏染色镜检，观察菌落形态；将脾、肝、脑、卵巢、小肠病料混合，取混合后的病料进行研磨，生理盐水稀释，离心取上清备用。

1.2.2 DNA及RNA的提取（1）DNA的提取：取培养基上单个菌落生理盐水混合均匀，用DNA试剂盒提取DNA。（2）RNA提取及cDNA的合成：将处理后的病料用RNA试剂盒提取RNA，根据反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA。

1.2.3 PCR扩增（1）大肠杆菌毒力基因检测：根据参考文献[1]，合成相关的毒力基因进行PCR扩增，毒力基因引物序列如表1。（2）病毒PCR扩增：坦布苏病毒引物见参考文献[3]，F:5’C GGCTGGATGGGACACTA-3’, R: 5’ATGAG-CAG ATGGCGTTTG-3’。反应体系：cDNA 2.0 µl，2×Taq PCR Master Mix12.5 µl，上、下游引物1.0 µl，ddH2O 8.5 µl，总体积25 µl。PCR扩增条件：95 30℃ s、55 30℃ s，72 40℃ s，循环30次，72 10℃ min。反应条件：50 ℃ 反转录30 min；预变形3 min；94 ℃ 变性45 s，56 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸1 min，30个循环；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃ 反应结束。

表1 黏附素毒力基因引物序列

1.2.4 药敏试验镜检过的单个菌落用生理盐水稀释后，涂布棒均匀涂抹在营养琼脂培养基上，然后将12种药敏片有序排放，37℃恒温培养箱中过夜培养，观察。

2 结果

2.1 细菌学检测

麦康凯培养基上呈粉红色菌落，镜检后观察到革兰氏阴性，短小杆菌，多呈散发，初步诊断为大肠杆菌，见图1。

图1 大肠杆菌镜检图

2.2 PCR扩增

2.2.1 毒力基因检测结果检测目的条带为314 bp，大肠杆菌K99毒力基因一致，确定该菌株为产肠毒素大肠杆菌（ETEC），见图2。

2.2.2 病毒PCR扩增检测目的条带为750 bp，与预期一致，确定为坦布苏病毒感染，见图2。

图2 PCR扩增结果

2.3 药敏试验

抑菌圈直径＞20 mm为极敏，15～20 mm为高敏，10～14 mm为中敏，＜10 mm为低敏，0为耐药。由表1可见，分离到的细菌对丁胺卡那极敏，对环丙沙星高敏，对庆大霉素低敏，其他均不敏感。

表1 药敏试验结果

3 讨论

该鸭场暴发的疾病是坦布苏病毒与大肠杆菌的混合感染，鸭群在感染坦布苏病毒后，免疫力下降从而感染大肠杆菌。该鸭场内病菌应先控制细菌感染，药敏试验结果看出，该鸭场内病菌对很多抗生素有耐药性，说明该鸭场经常不规范使用抗生素进行治疗，给该鸭场造成了很大的隐患，发现疾病第一时间应及时确诊合理用药。

坦布苏病毒目前没有特定的治疗方法，只能提前疫苗接种。对于患病鸭场，应及时隔离病鸭并对鸭舍和鸭排泄物进行清洗、消毒，防止疾病的扩散，减少进一步的经济损失。保持鸭舍的干净、卫生，给鸭群提供良好的环境是控制疾病的第一步[4]。

4 结论

结合临床症状和病理剖解初步诊断为坦布苏病毒和大肠干菌混合感染。结合PCR检测，大肠杆菌毒力基因筛查，确定该株大肠杆菌为致病性大肠杆菌，病毒为坦布苏病毒感染。药敏试验结果表明，该菌株对丁胺卡那极敏，对环丙沙星高敏，对庆大霉素低敏，其他均不敏感。通过丁胺卡那治疗，该鸭肠疾病得到初步控制。