miR-542-3p在老年鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤进展中的作用及其临床意义

陈秀容 师怡 陈宁斌 吴晖 陈英 林耀发

(福建医科大学附属肿瘤医院(福建省肿瘤医院) 1淋巴瘤及头颈肿瘤内科，福建 福州 350014；2病理分子病理室)

鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤是一种发生于鼻部淋巴结外的非霍奇金淋巴瘤〔1〕。由于鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤缺乏特异性临床特征，故常常被误诊为鼻腔炎症〔2〕，因此，有必要寻找鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤相关的诊断和预后的生物标记物。miRNA是一类小的非编码RNA，在细胞增殖、分化、凋亡和肿瘤的发生发展中发挥重要作用，可成为诊断肿瘤和评判预后的生物标记物〔3〕。miR-542-3p在结直肠癌患者血清中低表达，并与TNM分期、淋巴血管间隙浸润和淋巴结转移有关，可作为诊断结直肠癌的生物标志物〔4〕。但是miR-542-3p在鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤中的表达、功能和临床意义尚不清楚。本研究通过收集鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤患者的组织标本及临床资料，旨在分析miR-542-3p在鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤中的表达和临床意义，并通过体外实验探究其对鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1一般资料 选取2016年1月至2020年12月在福建医科大学附属肿瘤医院(福建省肿瘤医院)诊断的56例初治鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤患者，另取同时期慢性鼻腔炎患者40例，男23例，女17例，60～78岁，平均(68.0±6.5)岁，分别制作病理石蜡标本。结外NK/T细胞淋巴瘤患者，年龄60～80岁，平均(72.2±4.6)岁。纳入标准：(1)所有病理切片由医院两名及以上病理主治医师确诊；(2)临床及病理学资料完整。符合以上全部标准的患者纳入本研究。排除标准：(1)既往接受过其他放疗、化疗、免疫治疗、靶向治疗或中西医结合治疗；(2)合并其他肿瘤。

1.2细胞 SNK-6鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤细胞于上海联迈生物工程有限公司购买。

1.3试剂及仪器 RPMI1640液体培养基和胎牛血清均购于博士德生物工程有限公司；miR-542-3p抑制剂、miR-542-3p抑制剂阴性对照、miR-542-3p模拟物和miR-542-3p模拟物阴性对照均由上海吉满生物科技有限公司合成；Trizol试剂和RevertAid RT 逆转录试剂盒购于美国Thermo Fisher公司；MTT试剂盒购于美国Sigma-Aldrich公司；一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(绿色荧光)、5-乙炔基-2-脱氧尿苷标记法(EdU)细胞增殖检测试剂盒和马血清购于上海碧云天生物技术有限公司；兔单抗B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、兔多抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶(Caspase3)和山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(H+L)均购于武汉爱博泰克生物技术有限公司。PR4100酶标仪购于美国Bio-Rad公司，SDS-900C倒置显微镜购于上海蔡康光学仪器有限公司，BX63荧光显微镜购于日本Olympus公司。

1.4方法

1.4.1实时荧光定量法(qRT-PCR)检测标本中miR-542-3p水平 取成对数期生长的各组细胞，使用Trizol试剂，提取细胞总RNA。引物序列如下。miR-542-3p上游引物：5′-UGUGACAGAUUGAUAA CUGAAA-3′，下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。U6作为内参，上游引物：5′-AACGCTTCACGA ATTTGCGT-3′，下游引物：5′-AACGCT TCACGAATTTGCGT-3′。用逆转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，取1 μl的cDNA样本，制备50 μl定量PCR体系，其中包含SYBRGreen荧光和miR-542-3p的引物，经历94℃预变性1 min，95℃变性25 s，62℃退火30 s，72℃延伸20 s，共35个循环。miR-542-3p的内参基因为U6，相对表达量的计算采用2-ΔΔCt法。

1.4.2细胞培养与转染 将SNK-6细胞株置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，于含5% CO2的培养箱中培养，取成对数生长期细胞，用0.25% 胰蛋白酶消化后接种于6孔板，37℃、5%CO2培养箱培养细胞融合度至70%左右。按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书操作，分别将miR-542-3p模拟物、miR-542-3p模拟物阴性对照、miR-542-3p抑制剂和miR-542-3p抑制剂阴性对照转染至细胞，并分别记为miR-542-3p组、miR-NC组、anti-miR-542-3p组和anti-miR-NC组，24 h后进行后续实验。

1.4.3MTT检测SNK-6细胞活力 取各组细胞，将细胞按5×103/ml接种于96孔板。另设空白对照组，仅加入细胞培养液。培养24、48、72 h后，分别加入5 mg/ml MTT 10 μl，继续孵育4 h。吸净上清液后加二甲基亚砜(DMSO)，于 37℃的条件下振荡10 min。用酶标仪在490 nm波长处测定各孔光密度OD值。

1.4.4EdU实验检测SNK-6细胞增殖能力 将转染后各组SNK-6细胞以2.5×105细胞/孔的密度接种于24孔板上，24 h后，加入50 μmol/L的EdU，于37℃孵育2 h，PBS洗涤，多聚甲醛固定0.5 h，随后用Aollo荧光染色反应液避光孵育0.5 h，甲醇洗涤3次，1×Hoechst33342反应液孵育30 min，PBS洗涤,荧光显微镜下随机拍照计数,并计算EdU阳性细胞百分率。

1.4.5Transwell小室检测SNK-6细胞侵袭能力 将0.05 g/L的基质胶按1∶8的比例稀释，铺于Transwell上室底，置于室温风干。上室加入50 μl无血清培养基。将SNK-6细胞以1×105个/ml的细胞密度接种于Transwell上室内；下室内加入500 μl含20%胎牛血清的培养液，并置于37℃，5% CO2培养箱内培养24 h；用棉签擦去PVPF膜靠近小室内面的细胞后，用95%的乙醇固定30 min，结晶紫染色20 min，清水冲洗3遍，放于倒置显微镜下观察并拍照。

1.4.6TUNEL法检测SNK-6细胞凋亡率 取各组对数期生长细胞，去培养基，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次。加入0.1% Triton X-100通透2 min，PBS洗涤2次，加入TUNEL反应液，避光孵育1 h。随后PBS洗涤3次，加入DAPI，用抗荧光淬灭封片液封片，在荧光显微镜下拍照。细胞凋亡率(%)=凋亡细胞/总细胞数×100%。

1.4.7Western印迹检测SNK-6细胞凋亡相关蛋白表达 收集各组SNK-6细胞，提取蛋白样品。取50 μl总蛋白上样于10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，转膜。室温下，采用5%脱脂牛奶封闭1 h。洗膜后，加入一抗在4℃下孵育过夜，洗膜，加入二抗在室温下孵育1.5 h。洗膜后，用电化学发光(ECL)显影，采用图像分析软件Image J对Western印迹实验所得结果图像进行灰度分析。

1.5统计学分析 采用SPSS22.0软件进行独立样本t检验、配对样本t检验、秩和检验、χ2检验。

2 结 果

2.1miR-542-3p在鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤中表达下调 通过qRT-PCR检测发现，56例鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤标本中miR-542-3p表达量(1.16±0.13)显著低于慢性鼻腔炎患者石蜡标本(2.24±0.19；t=8.13，P<0.01)。

2.2miR-542-3p表达水平与鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤临床病理特征的关系 按miR-542-3p在鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤石蜡标本中表达量的平均值为界限，将56例鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤患者石蜡组织标本分为高表达组(n=37)和低表达组(n=19)。结果显示，miR-542-3p在鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤石蜡标本中的表达量与患者临床分期有关(P<0.05)，而与性别、年龄、LDH水平、β2-MG和B症状无关(P>0.05)。见表1。

表1 鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤石蜡标本中 miR-542-3p表达与临床病理特征的关系(n)

2.3miR-542-3p对SNK-6细胞活力的影响 与miR-NC组相比，miR-542-3p 组SNK-6细胞24、48、72 h 的OD值显著降低；与anti-miR-NC组相比较，anti-miR-542-3p组SNK-6细胞24、48、72 h的OD值显著升高(P<0.05，P<0.01)。见表2。

表2 miR-542-3p对SNK-6细胞活力的影响

2.4miR-542-3p对SNK-6细胞侵袭的影响 通过Transwell法可知，与miR-NC组〔(83.41±7.51)个〕相比较，miR-542-3p组〔(67.37±6.02)个,t=2.87,P=0.04〕细胞侵袭数量显著降低；与anti-miR-NC组〔(77.12±7.41)个〕相比，anti-miR-542-3p组〔(96.78±8.89)个，t=2.94，P=0.04〕细胞侵袭数量显著增高。见图1。

2.5miR-542-3p对SNK-6细胞增殖的影响 与miR-NC组〔(39.22±3.91)%〕相比较，miR-542-3p组EdU阳性细胞率〔(28.81±2.81)%，t=3.74，P<0.05〕显著降低；与anti-miR-NC组〔(37.49±3.68)%〕相比较，anti-miR-542-3p组EdU阳性细胞率〔(47.16±4.65)%,t=2.82，P<0.05〕显著升高。见图2。

图1 miR-542-3p对SNK-6细胞侵袭的影响(结晶紫染色，×100)

2.6miR-542-3p对SNK-6细胞凋亡的影响 通过TUNEL法检测发现，与miR-NC组〔(8.72±0.83)%〕相比较，miR-542-3p组〔(20.63±1.91)%，t=9.91,P<0.01〕细胞凋亡率显著增高，与anti-miR-NC组〔(8.19±0.77)%〕相比较，anti-miR-542-3p组〔(3.61±0.32)%，t=9.51，P<0.01〕细胞凋亡率显著降低。见图3。

图2 miR-542-3p对SNK-6细胞增殖的影响(×100)

图3 miR-542-3p对SNK-6细胞凋亡的影响(×200)

2.7miR-542-3p对凋亡相关蛋白的影响 通过Western印迹实验发现，miR-NC组、miR-542-3p组、anti-miR-NC组和anti-miR-542-3p组Bcl-2蛋白表达量分别为(1.17±0.11)、(0.84±0.08)、(1.24±0.12)和(1.97±0.15)；Caspase3蛋白表达量分别为(1.06±0.1)、(1.97±0.16)、(0.97±0.09)和(0.38±0.05)，与miR-NC组相比较，miR-542-3p组Bcl-2蛋白表达量显著降低，Caspase3蛋白表达量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与anti-miR-NC组相比较，anti-miR-542-3p组Bcl-2蛋白表达量显著升高，Caspase3蛋白表达量显著降低(P<0.05)。见图4。

1～4:miR-NC组、miR-542-3p组、anti-miR-NC组、anti-miR-542-3p组图4 miR-542-3p对凋亡相关蛋白的影响

3 讨 论

鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤是一种局部破坏性和高度侵袭性的成熟淋巴样肿瘤，该病起病隐匿，许多患者在确诊时就已经累及多个淋巴结区，侵犯多个脏器〔5〕。因此寻找鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤诊断和治疗的生物标记物，对改善患者预后是具有重要作用的。

miRNA主要通过与mRNA的3′-URT相互作用，抑制其翻译或诱导其降解，是基因表达的关键调控因子〔6〕。miRNA在多种癌症中表达异常，可以作为癌症诊断、治疗和预后评估的工具〔7〕。miR-542-3p作为miRNA家族中的一员，作为抑癌基因参与多种肿瘤进展。有研究发现miR-542-3p在肝细胞癌中显著下调，且与肝细胞癌转移、复发及不良预后有关，可作为肝细胞癌诊断及评估的潜在生物标志物〔8〕。miR-542-3p在神经母细胞瘤中表达下调，且过表达miR-542-3p能诱导神经母细胞瘤细胞的凋亡并抑制其增殖〔9〕。在乳腺癌中，miR-542-3p表达下调，miR-542-3p通过与S1PR1的结合能显著抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭能力〔10〕。本研究提示miR-542-3p可能与鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤侵袭程度相关。进一步，细胞实验证实过表达miR-542-3p可抑制鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤细胞增殖、侵袭能力，并促进细胞凋亡。

综上，miR-542-3p在鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤显著降低，且与患者临床分期密切相关，另外miR-542-3p可抑制细胞增殖、侵袭能力并促进凋亡。本研究提示miR-542-3p可能是鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤患者诊断和治疗的新靶点。然而，本研究仍存在以下不足：首先，仅在细胞水平证实miR-542-3p在鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤细胞中的作用；其次，未识别miR-542-3p在鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤细胞中的作用机制。今后将开展小鼠实验进一步证实本研究结论并识别miR-542-3p的下游靶基因。